企鹅珍珠贝Dmrt 2基因的克隆及表达分析

潘珍妮, 余祥勇, 王梅芳, 曲炳良, 陈耀辉, 唐小玉, 于非非



企鹅珍珠贝2基因的克隆及表达分析

潘珍妮1, 余祥勇2, 王梅芳2, 曲炳良1, 陈耀辉1, 唐小玉1, 于非非1

(1. 广东海洋大学水产学院, 广东 湛江 524088; 2. 华南农业大学海洋学院, 广东 广州 510642)

本研究利用RACE-PCR技术获得企鹅珍珠贝()一个2基因cDNA的全长序列, 通过荧光定量PCR分析2基因在各组织中的表达特征, 以及在早期卵巢、成熟期卵巢、早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢中的表达变化。结果表明,2基因全长1 257bp, 其中开放阅读框(open reading frame, ORF)为951 bp, 编码316个氨基酸, 5′非编码区(untranslated region, UTR)为52 bp, 3′UTR为 254 bp, 第20 位到第73位氨基酸为DM结构域。预测其分子质量为36.61ku, 等电点为9.80。氨基酸序列比对显示该企鹅珍珠贝2基因与黑蝶真珠蛤()和马氏珠母贝()的2基因同源性(identity)最高, 分别为46.0%和45.7%。其中在DM结构域高度同源。荧光定量PCR分析组织表达特征显示,2在企鹅珍珠贝的外套膜、鳃、消化盲囊、足、精巢和卵巢均有表达, 其中在精巢中表达量最高(<0.05), 足为其次, 在闭壳肌中没有检测到2表达。对性腺发育不同时期的表达量分析发现,2在发育早期和成熟期卵巢中表达量都很低, 在发育早期精巢中表达量较高, 在成熟期精巢检测到最大表达量(<0.05), 到精巢排放期表达显著下降, 推测2可能与企鹅珍珠贝精巢的发育有关, 可能参与了企鹅珍珠贝雄性性别分化和性腺发育这一生理过程。

企鹅珍珠贝();2; 基因克隆; 表达分析; 性别决定和性腺发育

(doublesex and mab-3-related transcription factor)基因家族是指与果蝇()性别决定基因()和秀丽隐杆线虫()性别决定基因()同源的一类基因[1], 是一个古老的与性别决定有关的基因家族[2]。该家族基因编码的蛋白质含有一个高度保守的DM结构域, 通过锌指结构识别并结合特定DNA来调控目的基因的转录, 从而参与性别决定与发育[3-4]。迄今为止已发现了基因家族多个成员, 其生理作用涉及性别决定、胚胎发育和调控肌肉发育等多个方面[5-6]。2基因是t基因家族的重要组成成员之一, 被认为对胚胎中期体节形成以及胚胎后期器官形成起到重要作用[7-8],但是否参与了性别决定和分化则没有定论。在人类基因图谱中, 基因1、2和3位于9号染色体短臂2区4带3亚带(9p2.4.3), 该片段缺失会引起精巢发育不全, 甚至引起雄性胚胎向雌性逆转; 但在该片段缺失的性逆转患者中,1和2均缺失, 由于1是性别决定与分化的关键基因, 因此无法确定性逆转中2是否起到关键作用[9]。随着研究的深入, Matsushita等[10]研究发现2在粗皮蛙()精巢中表达, 可能参与精子的形成以及性别的分化。Yu 等[11]通过免疫组化分析发现2基因主要在马氏珠母贝()的精巢中表达, 在卵巢中未检测到表达, 暗示2基因参与马氏珠母贝精子形成过程。

企鹅珍珠贝(), 属软体动物门(Mollusca), 双壳纲(Bivalvia), 珍珠贝科(Pteriidae), 珍珠贝属()[12]。企鹅珍珠贝具有生长速度快、珍珠质分泌速度快的特点, 是培育优质海水珍珠的大型珍珠贝[13]。本研究建立了企鹅珍珠贝转录组数据库, 利用RACE-PCR技术克隆到企鹅珍珠贝2基因的cDNA全长序列, 利用荧光定量PCR技术分析2基因在企鹅珍珠贝各组织中的表达差异以及性腺发育不同时期中的表达差异, 以阐述2在企鹅珍珠贝性腺发育中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用企鹅珍珠贝采自广西北海涠洲岛野生群体, 300~350 g。

1.2 企鹅珍珠贝Dmrt2基因cDNA全长克隆

使用上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒分别提取企鹅珍珠贝各组织(外套膜、鳃、闭壳肌、消化盲囊、足、性腺)的总RNA, 按照SMARTer®RACE 5′/3′Kit说明书合成企鹅珍珠贝2的3′RACE模板和5′RACE模板。根据企鹅珍珠贝转录组测序结果, 设计企鹅珍珠贝2基因5′RACE的特异性引物和3′RACE的特异性引物(表1)。采用巢式PCR扩增法进行5′RACE和3′RACE扩增, 5′RACE和3′RACE PCR反应体系为2×SeqAmp Buffer 10 μL, SeqAmp DNA Polymerase 0.5μL, 5′RACE或3′RACE cDNA模板(100 ng/µL) 1μL, 10×UPM (10×Universal Primer Mix) 2 μL , 5′RACE或3′RACE outer引物(见表1)(10μmol/L) 0.5 μL, PCR-Grade H2O 6 μL。使用touch-down PCR程序扩增: 94℃ 30 s, 72℃ 2 min, 5个循环; 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 2 min, 5个循环; 94℃ 30 s, 68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 25个循环。第二轮巢式PCR扩增反应体系为50μL: 第一轮PCR扩增产物2μL, 5′RACE或3′RACE inner引物(10μmol/L) 2μL, NUP引物(10μmol/L) 2μL, 2×EasyTaq®PCR SuperMix 25μL, PCR-Grade H2O 19μL。得到的PCR产物经电泳分离、纯化后与pEASY®-T1 Cloning Vector连接, 转化, 过夜培养。筛选阳性克隆测序, 将获得的 3′端序列与 5′端序列进行拼接。根据拼接序列设计3′和5′验证引物, PCR验证拼接序列的正确性, 从而获得2 cDNA 全长序列。利用VecScreen软件(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen. html)去除载体序列, 获得企鹅珍珠贝2基因的cDNA全长序列。

1.3 Dmrt2基因的生物信息学分析

通过ORF Finder工具, 推导企鹅珍珠贝2基因编码的氨基酸序列; 通过Expasy网站(http: // web.expasy.org/compute_pi/)分析其相对分子质量和等电点; 经ProtScale软件分析氨基酸序列的疏水性; 经SignalP 4.1、TMHMM和SoftBerry-Psite分别预测其信号肽、跨膜结构及氨基酸基本功能位点; 经SMART对其进行功能结构域分析; 利用Clustal X (1.8)软件进行氨基酸同源比对, 用MEGA6软件构建系统进化树。

1.4 荧光定量PCR检测目的基因的表达特征

分别提取企鹅珍珠贝外套膜、鳃、闭壳肌、消化盲囊、足、精巢和卵巢的RNA, 反转录合成第一链cDNA, 进行荧光定量PCR检测。以18S rRNA基因作为内参, 以企鹅珍珠贝的外套膜为对照, 采用2–DDCt法计算2基因在不同组织中的表达水平, 每组设3个重复, 组间重复性和差异显著性用SPSS16.0分析。分别提取企鹅珍珠贝发育早期卵巢、成熟期卵巢、发育早期精巢、成熟期精巢和排放期精巢的RNA, 反转录合成第一链cDNA, 进行荧光定量PCR。方法同上。

表1 企鹅珍珠贝Dmrt2基因克隆及表达分析引物

2 结果与分析

2.1 企鹅珍珠贝Dmrt2基因的克隆和序列分析

运用RACE-PCR快速扩增技术得到2基因的cDNA全长序列并分析。企鹅珍珠贝的2基因cDNA全长1257bp, 其中开放阅读框(ORF)为951 bp, 编码316个氨基酸, 5′非编码区(UTR)为52 bp, 3′UTR为 254 bp, 包含30 bp的polyA尾巴, 如图1所示。登录号为: KY670720.1。

2.2 Dmrt2基因蛋白理化性质预测和分析

经ExPASy预测企鹅珍珠贝2蛋白分子质量为36.61ku, 等电点为9.80。疏水性分析得知2氨基酸序列总平均亲水系数为–0.843, 预测该蛋白属于亲水性蛋白。经TMHMM 2.0进行跨膜结构域预测, 显示没有跨膜区。SignalP4.1 预测其不存在信号肽, 属于非分泌型蛋白质。SoftBerry-Psite在线预测该序列功能位点, 发现酪蛋白激酶II磷酸化位点6个, N-糖基化位点和N-豆蔻酰化位点各一个, 蛋白激酶C磷酸化位点9个, CAAX box 1个, C-末端定位信号序列微体6个。同时使用SMART软件分析得出第20位到第73位氨基酸为DM结构域(图1)。

2.3 Dmrt2氨基酸序列同源性分析

采用Clustal X软件将企鹅珍珠贝的2基因与其他物种的2基因编码氨基酸进行多序列比对, 结果显示, 该基因与黑蝶真珠蛤(, AIE16095.1)和马氏珠母贝(, ADD97887.1)的2基因同源性(identity)最高, 分别为46.0%和45.7%; 与人(, AAF86295.1)和小鼠(, EDL41636.1)的2基因同源性最低, 都为27.5%。其中, 保守位点主要集中在DM结构域(图2)。将该企鹅珍珠贝2基因命名为2。

图1 企鹅珍珠贝Dmrt2基因序列分析

小写字母代表非编码序列(UTR); 大写字母代表开放阅读框(ORF); 方框代表起始密码子和终止密码子; 灰色框代表DM结构域

5′UTR and 3′UTR regions are shown in small letters; open reading frame is shown in capital letters; initiation codon and termination codon are shown in boxes; DM domain is shown in gray boxes

分别选取马氏珠母贝、黑蝶真珠蛤、光滑双脐螺(, XP_013083870 )creb、鸭嘴海豆芽(, XP_013397304.1)、尾曳鳃虫(, XP_014675559.1)和热带爪蟾(AAI35448.1)等物种的2基因编码的氨基酸进行聚类分析, Neighbor-joining(NJ)树如图3所示: 企鹅珍珠贝、马氏珠母贝和黑蝶真珠蛤都属于软体动物瓣鳃纲, 其2编码的氨基酸聚为一个小的进化分支; 光滑双脐螺、鸭嘴海豆芽和尾曳鳃虫聚为一个小的进化分支; 以上所有的动物聚为一个大的进化分支, 而热带爪蟾这一脊椎动物作为外群物种单独列为一个进化分支。

图2 企鹅珍珠贝与其他物种Dmrt2基因编码氨基酸比对

采用Clustal W软件对企鹅珍珠贝()、斑马鱼(NP_571027.1)、人(AAF86295.1)、小鼠(EDL41636.1)、马氏珠母贝(ADD97887.1)和黑蝶真珠蛤(AIE16095.1)的2基因氨基酸序列进行排序, 相同的氨基酸涂灰色表示

The alignment of2 among,, andby ClustalW. Those amino acids with 100% identity are marked in gray

图3 企鹅珍珠贝与其他物种Dmrt2氨基酸序列的系统进化树(NJ)

2.4 基因的组织定量分析

采用qRT-PCR技术分析2基因在企鹅珍珠贝外套膜、鳃、闭壳肌、消化盲囊、足、精巢和卵巢中的组织表达差异, 结果显示(图4), 除在闭壳肌未检测到2基因的表达外, 在企鹅珍珠贝各个组织中均检测到2基因表达。其中, 在精巢中表达量最高(<0.05), 其次是足和消化盲囊, 在外套膜、鳃和卵巢中的表达量较低。

不同发育时期性腺的qRT-PCR分析发现, 在发育早期雌性性腺、成熟期雌性性腺、发育早期雄性性腺、成熟期雄性性腺、排放期雄性性腺中都可检测到2基因转录本的存在, 但在雄性性腺中表达水平显著高于各期雌性性腺, 其中成熟期雄性性腺中表达量最高, 显著高于发育早期和排放期雄性性腺(<0.05, 图5)。这暗示着2基因可能参与了企鹅珍珠贝的雄性分化和性腺发育。

图4 Dmrt2基因在企鹅珍珠贝各组织的表达水平

M. 外套膜, G. 鳃, AM. 闭壳肌, DD. 消化盲囊, F. 足, T. 精巢, O. 卵巢相同字母表示差异不显著(>0.05), 不同字母表示差异显著(<0.05)

M. mantle; G. gill; AM. adductor muscle; DD. digestive diverticulum; F. foot; T. testis; O. ovary The same letters indicate no significant difference (>0.05); different letters indicate significant difference (<0.05)

图5 Dmrt2基因在企鹅珍珠贝不同时期性腺的表达水平

EO. 发育早期卵巢, MO. 成熟期卵巢, ET. 发育早期精巢, MT. 成熟期精巢, EMT. 排放期精巢相同字母表示差异不显著(>0.05), 不同字母表示差异显著(<0.05)

EO. early ovary; MO. mature ovary; ET. early testis; MT. mature testis; EMT. emission testis.The same letters indicate no significant difference (>0.05); different letters indicate significant difference (<0.05)

3 讨论

目前已在不同物种中发现了多个家族成员[14],其中哺乳动物发现了8个基因, 分别命名为1~8[15], 鸟类中发现了14共4个基因[16], 爬行类发现了16共6个基因[17], 两栖类发现了15共5个基因[18], 鱼类中发现了15共5种[19]。软体动物主要发现了15共5个基因[20]。在已发现的基因家族中, 除了人类与小鼠的8基因编码蛋白质的DM结构域不完整外, 其他基因均含有保守的DM结构域, 且DM结构域的序列成为家族成员命名的有力佐证。Wang等[21]发现12基因只含有DM结构域, 而35同时含有DM结构域和DMA结构域。本研究获得的企鹅珍珠贝基因编码的蛋白质序列只含有DM结构域; 同源性分析显示, 该企鹅珍珠贝基因与马氏珠母贝2基因具有最高的同源性, 两者相互印证, 故确定了该企鹅珍珠贝基因为2。

近年来对多个物种2基因的组织表达特征进行了分析, 许宝红等[22]研究发现2在中国大鲵()的精巢和肌肉中高表达, Yamaguchi等[23]报道在成年的红鳍东方鲀中()的眼、鳃、心脏、肠、头肾、肝脏、肌肉和脾都有表达, 但在性腺中表达最高。2在斑马鱼中的精巢、卵巢、脑、肌肉和肝中都有表达, 其中在肌肉中表达量最高, 其次是精巢, 且2在精巢中的表达量高于卵巢中的表达[24]。成鱼青鳉()2基因在精巢和卵巢中表达[25]。基因在黑蝶真珠蛤中的精巢中的高表达, 而在卵巢中只有微弱表达[26]。本文利用qRT-PCR技术检测2基因在不同组织中以及在雄性和雌性性腺中的表达情况, 结果显示,2基因在精巢中的表达量最高, 尤其在成熟精巢中表达量显著高于发育期精巢和排放期精巢, 而在卵巢及其他组织中的表达量低, 这与已有报道相吻合。

因2和1在染色体上的位置较近, 而已确定1是鱼类[27]、两栖类[28]、爬行类[29]、鸟类[30]、哺乳类[31]的重要性别决定和分化基因, 因此2的功能曾经是有争议的, 有的学者认为是因为1的突变或缺失影响了2的功能才导致动物由雄性转为雌性,2本身并不是性别分化和性腺发育的关键基因。但是, 越来越多的研究表明2参与了性别分化和性腺发育, 如Yu等[11]对马氏珠母贝中雌雄性腺发育不同阶段的原位杂交实验显示,2在马氏珠母贝雄性性腺成熟和性别分化过程中起了重要作用。结合我们的实验结果和已有报道, 我们推测在与马氏珠母贝亲缘关系很近的企鹅珍珠贝的雄性性别分化和性腺发育过程中,2可能与起到了重要作用。

此外,2基因在企鹅珍珠贝的足中也有较高的表达, 足是贝类的运动器官, 足中通常有4对收缩肌, 即前后收足肌, 前伸足肌和和中举举足肌各一对[32]。这可能与在肌肉中的高表达相一致[22, 24]。

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(本文编辑: 梁德海)

Molecular cloning and expression analysis of2 gene from

PAN Zhen-ni1, YU Xiang-yong2, WANG Mei-fang2, QU Bing-liang1, CHEN Yao-hui1, TANG Xiao-yu1, YU Fei-fei1

(1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. School of Marine Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

2 (doublesex and mab-3-related transcription factor 2) is an important member of thegene family with a highly conserved zinc finger-like DM domain and plays an important role in somite formation, organ formation, and skeletal patterning. This study was conducted to investigate the role of2 in sex determination and gonadal development in. The full-length cDNA of2 gene was characterized fromby RACE-PCR, and real-time PCR was performed to assess the expression of2 in different tissues and gonads of different growth periods. The results showed that the full-length cDNA of2 was 1257 bp, including a 5′UTR of 52 bp, a 3′UTR of 254 bp, and an open reading frame of 951 bp, which encoded a deduced protein of 317 amino acids. The DM domain was from 20 to 73 amino acids. The predicted molecular weight was 36.61 ku, and the isoelectric point was 9.80. The amino acid sequence alignment showed that2 ofshared 46.0% and 45.7% sequence identity with2 ofand, respectivelyThe real-time PCR results showed that2 was constitutively expressed in the mantle, gill, digestive diverticulum, foot, testis, and ovary, except in the adductor muscle. The expression level was highest in the testis (< 0.05), followed by the foot. The expression analysis in gonads of different growth periods revealed that2 had lower expression in early ovary and mature ovary, higher expression in early testis and emission testis, and the highest expression in mature testis (< 0.05). This study showed that2 might play a role in sex determination and gonadal development in

;2; gene cloning; sex determination and gonadal development

Feb. 17, 2017

Q341

A

1000-3096(2017)10-0117-08

10.11759/hykx20170417002

2017-02-17;

2017-04-12

广东省科技发展专项(2016A020210115); 广东省渔港建设和渔业发展专项(B201601-Z08, Z2014005); 广东海洋大学优秀青年教师项目(2014004); 广东海洋大学博士科研启动项目(E15041); 广东海洋大学创新强校重大科研项目(GDOU2016050248)

[Guangdong Provincial Science and Technology Program, No. 2016A020210115; Guangdong Marine Fishery Development Foundation No. B201601-Z08, No.Z2014005; Outstanding Young Teacher Foundation, No.2014004; Doctoral Scientific Research Foundation of GuangdongOceanUniversity, No.E15041; Guangdong Major Project of Innovation School, No.GDOU2016050248]

潘珍妮(1990-), 女, 硕士研究生, 研究方向为海洋经济动物发育生物学, E-mail: pzn52020@163.com; 于非非, 通信作者, 副教授, E-mail: yufeifei2000@163.com