模拟微重力与普通环境下小球藻耐酚性能比较与驯化研究

汪铁林，张志忍，王成成，王为国，王存文

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430073)

模拟微重力与普通环境下小球藻耐酚性能比较与驯化研究

汪铁林，张志忍，王成成，王为国，王存文

(武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430073)

为探究小球藻在普通环境和模拟微重力环境下对苯酚耐受性能的变化幅度以及驯化培养对小球藻耐酚及降酚能力的影响，从而明确在微重力环境下利用含酚废水大规模培养小球藻的可行性，比较了小球藻在普通环境和模拟微重力环境下的耐酚与降酚能力，并对其进行了驯化培养。结果表明，普通环境下小球藻最大苯酚耐受浓度为600 mg·L-1，而在模拟微重力环境下的最大苯酚耐受浓度提高到700 mg·L-1，且苯酚完全降解所需时间也明显缩短。通过驯化培养得到的小球藻耐酚性能提高，驯化后的小球藻在普通环境下最大苯酚耐受浓度为800 mg·L-1，在模拟微重力环境下最大苯酚耐受浓度达1 000 mg·L-1，同时小球藻在模拟微重力环境下降酚能力也显著提高。

模拟微重力；小球藻；苯酚；驯化

苯酚及其衍生物是水体中最常见的有机污染物之一，主要来源于炼油、农药、印染以及酚醛树脂等工业废水[1-4]，对人体、动植物以及微生物均有毒害作用。目前，对含酚废水的处理主要有吸附、萃取、离子交换等物理化学法和生物降解法，相对于前者，生物降解法由于具有成本低、操作简便、不造成二次污染等优点而得到了广泛应用[5-8]。虽然苯酚对生物的生长具有一定毒害作用，但有一些生物却对苯酚表现出一定耐受性并可将酚类物质加以降解[9]，如某些细菌[10]、真菌[11]、酵母[12]以及微藻[13]均表现出一定的耐酚能力。

微藻生物质由于具有光合作用效率高、油脂含量高、生长周期短、生长速度快、生态分布广、不占耕地等优势，作为生物质能源原料倍受关注。采用含酚废水培养富油微藻，一方面利于环境保护，另一方面可以收获生物质能源原料。而苯酚分子的疏水作用会破坏微藻细胞膜结构，导致微藻生长受到抑制，因此关于耐酚藻种的筛选与驯化是利用微藻降解含酚废水的关键[1]。虽然多种微藻均能在含酚溶液中生长，但仅有Chlorellaspp.、Scenedesmus obliquus 和 Spirulina maxima等数种微藻对苯酚具有良好的降解能力[14-16]，且经过驯化后的微藻对苯酚的耐受和降解能力均能得到较大幅度的提高[5]。

微重力环境可能会对轮藻、杜氏盐藻等微藻的代谢、发育、生殖、衰老等生理生化过程产生影响，使微藻的生长加快[17-19]。太空飞行和地面回转器的实验结果表明，微重力改变了微藻机体与介质环境的相互联系，从而影响微藻的代谢。为探索在微重力环境下利用含酚废水高密度、短耗时的大规模培养微藻的可行性，作者以小球藻为研究对象，比较了在普通环境和模拟微重力环境下小球藻的耐酚与降酚能力，并对小球藻进行了耐酚驯化培养实验。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

实验中使用的藻种为小球藻(Chlorellasp.)，其编号为FACHB-9，由中国科学院武汉水生生物研究所提供。采用BG-11培养基作为基础培养基。所用试剂均为分析纯。

UV-6000型紫外可见分光光度仪，上海元析仪器有限公司；旋转细胞培养系统，美国Synthecon INC公司；LRH-300-GSIT型二氧化碳人工气候箱，上海银泽仪器设备有限公司；托马细胞计数器，上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培养

用经过高压灭菌后的BG-11培养基将处于成熟期的小球藻藻液稀释10倍，再将藻液均分为多个组别，分别向其中添加不同浓度苯酚后用于实验。

将预处理后含不同浓度苯酚的藻液分别注入RCCS的回转器中作为实验组，同时将等体积藻液注入100 mL锥形瓶中作为对照组。将实验组与对照组置于人工气候箱中培养，每24 h测定一次细胞密度和苯酚浓度。

根据初次培养实验结果，分别在普通环境和模拟微重力环境下对小球藻进行耐酚驯化培养实验。

以上实验培养条件均为：温度(25±2) ℃、冷白荧光光照强度4 000 lx·cm-2、光照时间比12 h∶12 h。

1.2.2 苯酚浓度的测定

采用4-氨基安替比林显色法[20]测定苯酚浓度。

1.2.3 苯酚降解率的计算

测定苯酚浓度后，按式(1)计算特定时间内的苯酚降解率。

(1)

式中：D为苯酚降解率；ct、c0分别为时间t时刻和起始时刻的苯酚浓度，mg·L-1。

2 结果与讨论

2.1 普通环境下苯酚对小球藻生长的影响

研究表明，在普通环境下未驯化的小球藻的最大苯酚耐受浓度为600mg·L-1，并且苯酚浓度为100～200mg·L-1时，苯酚对小球藻的生长起到轻微的刺激作用[5]。因此，本实验在普通环境下分别在培养基中添加浓度为0～600mg·L-1的苯酚对小球藻进行培养，结果如图1和图2所示。

图1 普通环境下小球藻在含不同浓度苯酚 培养基中的生长曲线Fig.1 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with differentconcentrations of phenol under general condition

由图1可知,当苯酚浓度低于600 mg· L-1时，小球藻能正常生长，生长前2 d为适应期，生长速度缓慢。相对于对照组，苯酚浓度为200 mg· L-1时，小球藻的生长表现出轻微的刺激作用，在第4 d时生物量超过对照组，这与文献[5]报道结果基本一致。随着苯酚浓度的增大，小球藻的生长速度逐渐减缓。当苯酚浓度过高，达到600 mg· L-1时，小球藻细胞在短时间内迅速减少，直至生长停止，藻细胞全部死亡。

图2 普通环境下小球藻培养液中苯酚浓度的变化Fig.2 Phenol concentration changes of Chlorella sp. culture medium under general condition

由图2可知，当苯酚浓度低于600 mg· L-1时，培养基中的苯酚均能在9 d内被小球藻几乎完全降解。值得指出的是，在长时间观测过程中由于苯酚挥发扩散到空气中从而导致其浓度下降，但考虑到在一个培养周期内苯酚挥发量相对于生物降解量较小，因此在本实验中未考虑自然挥发的苯酚量。

2.2 模拟微重力环境下苯酚对小球藻生长的影响

研究表明，在微重力环境下，植物细胞的生长代谢、形态结构等多种特性均会发生改变，尤其是藻细胞的生长速率会明显加快[21]。图3为模拟微重力环境下小球藻在含不同浓度苯酚培养基中的生长曲线。

图3 模拟微重力环境下小球藻在含不同 浓度苯酚培养基中的生长曲线Fig.3 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

由图3可知，与普通环境相比，在模拟微重力环境下小球藻对苯酚的耐受性明显提高，小球藻的最大耐受苯酚浓度由600 mg·L-1提高到700 mg·L-1，说明微重力环境对小球藻的耐酚能力起到了促进作用。

图4为模拟微重力环境下小球藻培养液中苯酚浓度的变化。

图4 模拟微重力环境下小球藻培养液中苯酚浓度的变化Fig.4 Phenol concentration changes of Chlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

由图4可知，模拟微重力环境对小球藻的苯酚降解速率也产生了明显的影响，培养液中不同浓度的苯酚被完全降解所需时间比在普通环境下明显缩短。当苯酚浓度为500 mg·L-1时，完全降解时间由普通环境下的9 d缩短为模拟微重力环境下的6 d。原因可能是，模拟微重力环境下小球藻生长代谢加快，培养液中碳源消耗加速，从而加快苯酚的降解。

2.3 不同环境下苯酚对驯化后小球藻生长的影响

为探究驯化过程对小球藻耐酚及降酚能力的影响，根据初次培养实验结果对小球藻进行了耐酚驯化培养。分别对初次实验中普通环境下苯酚浓度为400 mg·L-1及微重力环境下苯酚浓度为500 mg·L-1的条件下生长到对数期的两种小球藻进行驯化培养。

2.3.1 普通环境下苯酚对驯化后小球藻生长的影响

普通环境下的小球藻驯化培养实验结果如图5和图6所示。

图5 普通环境下驯化后的小球藻在含不同 浓度苯酚培养基中的生长曲线Fig.5 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under general condition

对比图1和图5可知，在普通环境下，在含不同浓度苯酚的培养基中培养的小球藻最大细胞密度在驯化前后变化不大，如苯酚浓度为400 mg·L-1时，最大藻细胞密度在驯化前后均约为1.2×107cell·mL-1。在普通环境下驯化后的小球藻在苯酚浓度为0～500mg·L-1的培养基中生长速率基本与驯化前保持一致，均经过2 d的适应期后生长速度加快。而驯化后小球藻的最大苯酚耐受浓度明显提高，未经驯化的小球藻在苯酚浓度达到600 mg·L-1时生长受到完全抑制，在第9 d全部死亡，而经过驯化的小球藻在苯酚浓度达到800 mg·L-1时生长才表现出完全抑制，于培养第6 d才全部死亡。小球藻的最大苯酚耐受浓度较未驯化时提高了约三分之一，说明驯化过程虽未改变低浓度苯酚中小球藻的生长速率，但能显著提高其对苯酚的耐受能力。

图6 普通环境下驯化后小球藻培养液中苯酚浓度的变化Fig.6 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under general condition

对比图2和图6可知，驯化培养实验中苯酚的降解速率明显增大。普通环境下未驯化的小球藻在苯酚浓度分别为400 mg·L-1、500 mg·L-1、600 mg·L-1的培养基中培养4 d后，培养基中的苯酚浓度分别为128 mg·L-1、298 mg·L-1、365 mg·L-1，苯酚降解率分别为68.0%、40.4%和39.2%；而经过驯化的小球藻在对应的第4 d苯酚降解率分别达到74%、65%和62%。表明驯化过程不仅增强了小球藻的耐酚能力，同时也增强了其降酚能力。藻类对苯酚的降解可能是由于在苯酚的诱导下形成酶的作用，因此经过驯化后藻体降解苯酚的能力有所提高[5]。

2.3.2 模拟微重力环境下苯酚对驯化后小球藻生长的影响

模拟微重力环境下的小球藻耐酚驯化培养实验结果如图7和图8所示。

对比图3和图7可知，模拟微重力环境下，小球藻在含不同浓度苯酚的培养基中驯化后最大细胞密度较驯化前均有一定提升，在苯酚浓度为600 mg· L-1的培养基中，驯化后的小球藻最大细胞密度从驯化前的9.8×107cell·mL-1增长到1.29×108cell·mL-1，增长了31.6%。表明在模拟微重力环境下，驯化过程不仅改变了小球藻对苯酚的耐受性，同时也加快了小球藻的生长速率。但随着苯酚浓度的进一步增大，小球藻生长速率逐渐减缓。当苯酚浓度达到1 000 mg· L-1时，小球藻生长受到完全抑制，与未驯化的小球藻相比，最大苯酚耐受浓度提高了300 mg· L-1。微重力环境下驯化过程对小球藻耐酚能力的提高和生长代谢的加速要比普通环境下更为显著。

图7 模拟微重力环境下驯化后的小球藻在含不同 浓度苯酚培养基中的生长曲线Fig.7 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

图8 模拟微重力环境下驯化后小球藻培养液中苯酚浓度的变化Fig.8 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

对比图2和图8可知，当苯酚浓度为400 mg·L-1、500 mg·L-1时，模拟微重力环境下经过驯化的小球藻在第4 d苯酚降解率分别为75%和 67%,说明小球藻驯化后在模拟微重力环境下的苯酚降解速率较普通环境下亦有所提高。模拟微重力环境下苯酚降解速率提高的原因在于，一方面小球藻生长速率加快导致碳源消耗速率加快，另一方面由于模拟微重力下细胞膜脂质层分子之间的距离有所增大，提高了膜的流动性和通透性[22]，导致苯酚能够更快地渗透入细胞内部，从而加快了苯酚的降解。

3 结论

比较了小球藻在普通环境和模拟微重力环境下的耐酚与降酚能力，并对其进行了驯化培养。结果表明，普通环境下小球藻最大苯酚耐受浓度为600 mg· L-1，而在模拟微重力环境下的最大苯酚耐受浓度提高到700 mg· L-1，且苯酚完全降解所需时间也明显缩短。通过驯化培养后的小球藻耐酚能力明显提高，驯化后的小球藻在普通环境下最大苯酚耐受浓度为800 mg· L-1，而在模拟微重力环境下最大苯酚耐受浓度达1 000 mg· L-1。同时小球藻在模拟微重力环境下降酚能力也显著提高，驯化后的小球藻在苯酚浓度为600 mg· L-1的培养基进行培养，其最大细胞密度比未驯化时增长了31.6%。驯化过程能有效增强小球藻的耐酚与降酚能力，但其具体机理尚待进一步研究。

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Phenol-Tolerant Characteristic and Domestication ofChlorellasp.under Simulated Microgravity and General Conditions

WANG Tie-lin，ZHANG Zhi-ren，WANG Cheng-cheng，WANG Wei-guo，WANG Cun-wen

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

InordertomakeclearthefeasibilityofcultivationofChlorellasp.onalargescaleusingphenolicwastewaterundermicrogravitycondition,thevariationrangeofphenoltoleranceofChlorellasp.aswellasthepotentialinimprovingthephenol-tolerantandphenol-degradingabilitiesbydomesticationcultureundergeneralconditionandsimulatedmicrogravityconditionwereinvestigated.Theresultsshowedthat,themaximumphenoltoleranceconcentrationwas600mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationincreasedto700mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition,andthecompletedegradationtimeofphenolshortenedobviously.Thephenol-tolerantabilityofChlorellasp.improvedbydomesticationculture.ThemaximumphenoltoleranceconcentrationofChlorellasp.was800mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationreachedupto1 000mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition.Meanwhile,thephenol-degradingabilityofChlorellasp.improvedsignificantlyundersimulatedmicrogravitycondition.

simulatedmicrogravity;Chlorellasp.;phenol;domestication

湖北省自然科学基金资助项目(2015CFB580)，湖北省科技支撑计划资助项目(2013BHE001)

Q 949.217

A

1672-5425(2017)01-0039-05

汪铁林，张志忍，王成成，等.模拟微重力与普通环境下小球藻耐酚性能比较与驯化研究[J].化学与生物工程，2017，34(1)：39-43.