辣椒素对乌拉坦诱导的小鼠肺癌的影响

李海云,林玉坤，张舒慧，段永建，杜钢军

1.河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004； 2.河南大学第一附属医院，河南 开封 475004

目前，恶性肿瘤占全球死因的第1位，而肺癌是癌症相关死亡的首要原因[1]，5 年内生存率仅有15%。根据预测，到2020年，中国将有550万新发肺癌病例，死亡的人数将达400万[2]。在我国，无论城市、农村都是肺癌发病率及死亡率的高发地。吸烟、大气污染、遗传/家族性因素、放射性暴露都能成为肺癌发生的致病因素[3]。汪宗发等[4-5]提到，肺癌是因为阴阳失衡，正气虚损，邪毒趁机侵入肺腑，引起肺脏功能失调，导致肺气郁结于内，血行受阻，津液循环受限，津聚化痰，淤阻脉络，痰聚气滞，使得瘀毒胶结。因此，日积月累肺部便生长出肺积块，它本质属阴邪。肺癌是因为虚损而病发，因虚而致实，是因虚而致病，是全身性疾病的一个局部的表现[6]。其虚一般都是气虚、阴虚和气阴虚。表现出的则是毒聚、气滞、血瘀、痰凝的病理变化。

中药辣椒素具有多种药理活性，如镇痛、降脂、抗真菌、抗炎及抗肝癌等[7]。黄媛媛[8]研究报道称，辣椒素可以通过抑制NF-KB表达，下调XIAP的表达，抑制胰腺癌细胞裸鼠移植瘤生长。但在《全国中草药汇编》中提示，辣味具有发散、行气、活血化瘀的药理效用，过多摄入易导致肺气过盛，耗伤气阴，导致免疫力降低。因此，从中医角度讲，辣椒素对肿瘤是否具有抑制作用，仍有待考究。且辣椒素对于阴虚、气虚的患者反而加重症状。近年，国内趋向于对辣椒素抑制肿瘤生长状况的研究和报道，但也有研究提到辣椒素的致突变及致癌作用。本实验对乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型在给予辣椒素(25 mg/kg)后，观察辣椒素对小鼠肺癌模型的影响。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

实验动物：昆明小鼠，雌性，体质量25～30 g，采购于河南省实验动物中心。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 试剂 CMCNa (国药集团化学试剂有限公司)；乌拉坦(上海化学试剂厂产品)；体积分数4%的多聚甲醛、苏木精、伊红(美国Sigma)；PBS缓冲液、蒸馏水、盐酸酒精、不同梯度的酒精(用无水乙醇配制)、EDTA-2Na(郑州市宏播利化工有限公司)；中性树脂(开封市天济大药房)；辣椒素(开封市天济大药房)；TF ELISA测定试剂盒(北京方程佰金科技有限公司)；血细胞分析仪通用稀释液(北京瑞博赛工贸有限公司)。

1.2.2仪器 电子天平(上海精密仪器有限公司有限公司天平仪器厂)；电子体温计(香港泰克曼电子仪器有限公司)；EM-KC150数显游标卡尺(河东区星光扳钳工具厂)；ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；正置显微镜XDS-500D(奥林巴斯，日本东京)；KD202C转轮式切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司)；XFA6130全自动动物血液细胞分析仪(南京普明医疗设备有限公司)；冰箱(坂田)；J-HH-4A精密数显恒温水浴锅(上海胜卫科技有限公司)等。

2 实验方法

2.1 建立小鼠肺癌模型

采用多次腹腔注射乌拉坦(600 mg/kg)，1次/周，连续注射10周，建造肺癌模型。

2.2 实验分组与给药

将60只小鼠随机分成模型组，辣椒素组，正常组，每组20只。次日灌胃给药(辣椒素组：辣椒素25 mg/kg；模型组：蒸馏水0.2 mL/10 g)。1次/d，连续喂养6 mon。

2.3 检测指标

2.3.1 一般日常观察 每周必须观察3组小鼠的饮食、饮水情况，测量小鼠的体质量、体温和自主活动；对6个月内死亡小鼠的死亡数目进行统计并做记录，计算死亡率。

2.3.2 肿瘤数目及瘤直径计算 实验结束，摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，解剖分离完整肺组织，拍照，观察小鼠肺部长瘤情况，统计小鼠肺组织表面肿瘤数目及测量瘤直径，计算出肿瘤体积。

2.3.3 脏器指数计算 解剖得到的小鼠完整心、肝、脾、肺、肾进行称重，并计算脏器指数。

2.3.4 血常规分析 实验结束，摘眼球取血收集小鼠血液，选择预稀释模式进行血常规分析，记录并分析数据。

2.3.5 组织因子含量分析 使用IF ELISA试剂盒，测量小鼠血清中组织因子含量，并进行分析。

2.4 病理指标检测

小鼠处死后，收集各组小鼠肺组织，做好标记，将各组小鼠肺组织浸泡在体积分数4%的多聚甲醛溶液中，两天后进行石蜡包埋，切取4 μm制片，乙醇脱水透明，然后做封片处理。作HE染色片，于显微镜下观察小鼠肺组织的病理生理形态变化。

2.5 统计学分析

用GraphPad Prism 5.0软件对本实验得到的数据进行分析。结果采用t检验，比较辣椒素组和模型组间的差异性，样本数据均采用单因素方差分析。P<0.05，具有统计学意义；P<0.01，具有显著统计学意义。

3 实验结果

3.1 血常规分析辣椒素对WBC、LY的影响

与正常组相比，辣椒素组小鼠血液中WBC含量最低(P<0.05)，其次是模型组，见图1；而辣椒素组小鼠血液中LY含量最高(P<0.05)，其次是模型组，见图2。

3.2 对小鼠组织因子(TF)的影响

与正常组相比，辣椒素组小鼠血液中TF含量最高(P<0.05)，其次是模型组，见图3。

3.3 对小鼠肺组织质量的影响

与正常组小鼠比较：辣椒素组小鼠肺脏器指数最高(P<0.05)，其次是模型组，见图4。解剖过程中，我们还发现辣椒素组小鼠肺组织体积比正常组小鼠肺组织体积偏大，体型部分较其他两组瘦小。

图1 小鼠血液中WBC含量比较

图2 小鼠血液中LY含量比较

图3 小鼠血液中的组织因子(TF)含量比较

3.4 对肿瘤体积和肿瘤数目的影响

与模型组比较：辣椒素组小鼠肺组织肿瘤数目低，但肿瘤体积明显高于模型组,见图5、图6。我们发现造成上述结果的原因是辣椒素组肺组织肿瘤体积偏大，有的甚至长满整个小肺叶或是布满半个肺叶，而模型组的肺组织肿瘤体积偏小，散布在肺组织的不同区域，见图7。同时，我们对死亡途中的辣椒素组小鼠肺组织解剖发现，肺部有出血的情况，实验结束后，处理的小鼠中也存在了出血情况，见图8。

3.5 HE病理学检测结果

正常组小鼠肺泡组织排列整齐，无瘤区，无炎症浸润现象；辣椒素组瘤区明显且体积大，有炎症浸润现象，细胞核密集，而且核质失衡；模型组有炎症浸润现象，有瘤区，但均比辣椒素组情况好，见图9。

3.6 对小鼠体质量、体温、自主活动、饮水量的影响

结果显示：模型组与辣椒素组小鼠体质量均有增长趋势，其中模型组增长较辣椒素组增长缓慢，但无统计学意义，见图10；辣椒素组和模型组小鼠的体温变化趋势基本一致，辣椒素组体温略微高于模型组，趋近于正常组，见图11；两组小鼠自主活动变化趋势基本一致，辣椒素组小鼠自主活动始终高于模型组，见图12；辣椒素组小鼠饮水量明显高于模型组，见图13，可能是因为辣椒素组小鼠在给予辣椒素后，大量饮水所造成的。

图4 小鼠的肺脏器指数比较

图5 小鼠肺部肿瘤的体积比较

图6 小鼠肺部肿瘤的数目比较

图7 小鼠肺组织瘤体表面情况比较

图8 小鼠肺组织出血情况比较

图9 小鼠肺组织HE染色图

图10 小鼠的体质量变化

图11 小鼠的体温变化

图12 小鼠的自主活动变化

图13 小鼠的饮水状况统计

4 讨论

中药辣椒素是辣椒属红辣椒有效活性成分，它是香草酰胺衍生物，别名辣椒碱，具有刺激性[7]。实验研究中，给予小鼠辣椒素50mg/kg时，小鼠出现死亡现象；将给予辣椒素的量更改为25mg/kg后，小鼠饮水量增加，猜测这与辣椒素的刺激性有关。

本实验主要探讨辣椒素对乌拉坦诱导的肺癌小鼠的影响。实验中，辣椒素致死率为52.17%，模型死亡率为39.13%，说明辣椒素促进了小鼠的死亡。有研究表明，肺癌容易伴有异常凝血状态，这与TF高水平表达，导致TF/TFPI平衡失调，产生高凝状态有关[9]。实验显示，辣椒素组TF含量最高(P<0.05)，解剖得到的小鼠肺组织中，辣椒素组小鼠肿瘤体积大，肺组织表面出现血块，而模型组没有出现此现象。说明辣椒素组中TF高表达引起TF/TFPI失调，进而导致小鼠肺组织凝血异常，加速了小鼠的死亡。血液分析结果显示，辣椒素组小鼠血液中的WBC含量值最低(P<0.05)。说明辣椒素可能通过降低了小鼠免疫力而加速肿瘤进程。

肿瘤具有复杂的肿瘤微环境，比如形成的肿瘤脉管，它能促进LY浸润，又在某种程度上阻碍LY浸润，比如血管生成调节因子的异常表达[10]。VEGF能够刺激肿瘤脉管的形成及内皮细胞的增殖，形成能够有利于LY浸润的肿瘤脉管系统[11]；VEGF在大部分实体瘤内的高表达，能够激发肿瘤内新生脉管的生成，从而促进LY对肿瘤的浸润[12]。实验结果表明，辣椒素组小鼠血液中LY含量高于模型组(P<0.05)，说明LY对辣椒素组小鼠肺部肿瘤浸润程度更高，辣椒素组小鼠患肺癌程度上更为严重。实验中，辣椒素组小鼠是否因为肿瘤内VEGF高表达促进了肿瘤脉管的形成导致血管生成调节因子异常表达，阻碍了LY的浸润而导致LY在数量上蓄积，仍有待进一步研究。

综上所诉，本实验研究的25mg/kg辣椒素对乌拉坦诱导的小鼠肺癌具有促进作用。

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