干扰TRPM7对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响

李利华，卢滨，吴红科，张浩，姚菲菲

（河南省郑州人民医院呼吸科，河南郑州450003）

论著

干扰TRPM7对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响

李利华，卢滨，吴红科，张浩，姚菲菲

（河南省郑州人民医院呼吸科，河南郑州450003）

目的研究干扰瞬时受体电位通道7（TRPM7）对人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法用转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激人胚肺成纤维细胞WI-38和MRC-5，Western blot检测细胞平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原Ⅰ的表达，来评价细胞的转化。用实时聚合酶链反应（Real-time PCR）和Western blot检测细胞中TRPM7的表达。将特异性的TRPM7 siRNA转染到细胞中，并将细胞分为对照组、模型组、TRPM7 siRNA组、转染非特异性siRNA组（Scramble组）。检测转化过程中相关蛋白α-SMA、胶原Ⅰ、Smad3、p-Smad3及Smad7的表达。结果TGF-β1（15μg/L）作用24h后，成功诱导肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。与对照组比较，模型组细胞中TRPM7 mRNA和蛋白高表达，且细胞中α-SMA、胶原Ⅰ、Smad3及p-Smad3的蛋白表达增多，Smad7表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，TRPM7 siRNA转染组细胞TRPM7 mRNA和蛋白低表达，且α-SMA、胶原Ⅰ、Smad3及p-Smad3的表达下降，Smad7的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论下调TRPM7可在一定程度上干预肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，该作用可能与TGF-β1/Smads信号通路有关。

瞬时受体电位通道7；肺纤维化；肺成纤维细胞；TGF-β1/Smads信号通路

特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种严重的弥漫性肺间质疾病，病因不明、发病机制不清[1]，且全球发病率、死亡率不断上升[2]。IPF是特发性间质性肺炎最常见最致命的形式[3]，最终可导致呼吸衰竭，且预后极差[4]。尽管目前对于该病有诸多治疗方法，但是疗效仍不理想。因此，研究并阐明其发病机制，寻找新的治疗靶点，对攻克该病至关重要。

瞬时受体电位通道7（transient receptor potential channel 7，TRPM7）是细胞膜上的一类重要的阳离子瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels，TRP）家族成员之一，TRPM7包含TRP离子通道与蛋白激酶域融合区域的双功能膜蛋白[5]，可使自身或底物磷酸化，也被称为通道酶[6]。TRPM7广泛存在于机体中，参与细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等多种生理过程[7]。TRPM7在纤维化疾病的发病过程中扮演着重要角色[8-9]，但其在肺纤维化中的作用至今鲜见报道。本实验用人胚肺成纤维细胞系MRC-5和WI-38为研究对象，探讨干扰TRPM7对转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人胚肺成纤维细胞系WI-38和MRC-5购自中国科学院上海细胞库，达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，重组人的TGF-β1购自以色列Pro Spec公司（批号：810TGFB131），兔抗人平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（货号：ab5694）、兔抗人TRPM7抗体（货号：ab109438）、小鼠抗人胶原Ⅰ抗体（货号：ab6308）、兔抗人Smad3抗体（货号：ab40854）、兔抗人p-Smad3抗体（货号：ab52903）购自美国Abcam公司，小鼠抗人Smad7抗体（货号：sc-365846）和小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（货号：sc-47778）购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗小鼠IgG（货号：SN133）和HRP标记的山羊抗兔IgG（货号：SN134）购自南京生兴生物技术有限公司，LipofetamineTM2000、TRIzol试剂盒与逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，无线电免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液来自美国Sigma-Aldrich公司，TRPM7 siRNA片段由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 细胞培养

分别将MRC-5细胞和WI-38细胞置于10％ FBS的DMEM培养基、37℃、5％二氧化碳CO2培养箱中培养，至80％融合后，更换无血清培养基，待用。

1.3 肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化模型的复制

分别用0、5、10、15和20μg/L TGF-β1诱导MRC-5和WI-38细胞24 h。用Western blot检测相关蛋白的表达，筛选细胞模型。

1.4 TRPM7 siRNA序列的设计及转染

将人胚肺成纤维细胞WI-38和MRC-5接种于6孔板（2.0×105个/孔），待细胞生长至70％～80％时，更换无血清培养基，按照LipofetamineTM2000说明书进行操作，分别将TRPM7 siRNA或非特异性siRNA（Scramble）转染细胞48 h。

HPLC法需要的试剂较多，需要接触OTA的标准品，使用的免疫亲和柱也需要冷藏保存，需要避免移动色谱仪，便携性不强，实验耗时较长。但是该方法的重复性好、准确度高，因此国家标准中推荐使用此方法[16-20]。

1.5 实验分组

将细胞分为对照组、模型组、Scramble组和TRPM7 siRNA组。对照组细胞正常培养，模型组细胞用筛选出浓度的TGF-β1刺激24 h，Scramble组和TRPM7 siRNA组细胞分别转染非特异性siRNA或TRPM7 siRNA后同模型组进行相同处理。

1.6 实时聚合酶链反应检测TRPM7 mRNA的表达

分别提取MRC-5和WI-38细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后逆转录合成cDNA，并转录为DNA，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）产物用1％琼脂糖凝胶电泳。TRPM7正向引物：5'-GCAA ATGACTCCACTCTC-3'，反向引物：5'-GATTCTCTCT TCACTCCCAG-3'；内参GAPDH正向引物：5'-ACAG CAACAGGGTGGTGGAC-3'，反向引物：5'-TTTGAGG GTGCAGCGAACTT-3'。根据2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，实验重复3次。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.7 Western blot检测α-SMA、胶原Ⅰ、TRPM7、Smad3、p-Smad3及Smad7蛋白的表达

用0.05％胰蛋白酶消化细胞，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，加入细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白并测定其浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳分离后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5％脱脂奶粉、2％牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、0.2％Tween-20的PBS液的封闭液室温下封闭2 h，4℃下过夜孵育一抗，包括小鼠抗人TRPM7抗体（1∶1 000）、兔抗人α-SMA抗体（1∶100）、小鼠抗人胶原Ⅰ抗体（1∶500）、小鼠抗人Smad3抗体（1∶1 000）、兔抗人p-Smad3抗体（1∶2 000）、兔抗人Smad7抗体（1∶500）和兔抗人GADPH抗体（1∶1 000），洗膜后，加入二抗（1∶4 000），用化学发光法进行显色反应。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 Western blot检测不同浓度TGF-β1对WI-38和MRC-5细胞中α-SMA和胶原Ⅰ表达的影响

2 结果

分别用0、5、10、15和20μg/L TGF-β1刺激WI-38和MRC-5细胞24 h，各组α-SMA和胶原Ⅰ的相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（WI-38细胞：F=51.126和59.181，P=0.000；MRC-5细胞：F=59.690和49.163，P=0.000），均呈递增趋势（见图1）。5μg/L TGF-β1组α-SMA和胶原Ⅰ的表达量与对照组比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（WI-38细胞：t=1.802和3.339，P=0.165和0.198；MRC-5细胞：t=2.328和3.157，P=0.091和0.172）。10、15和20μg/L TGF-β1组α-SMA和胶原Ⅰ的表达量与对照组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（WI-38细胞10μg/L TGF-β1组：t=4.189和2.681，P=0.019和0.024；WI-38细胞15μg/L TGF-β1组：t=9.675和10.653，P=0.000；WI-38细胞20μg/L TGF-β1组：t=14.516和15.482，P=0.000；MRC-5细胞10μg/LTGF-β1组：t=2.816和3.462，P=0.039和0.015；MRC-5细胞15μg/L TGF-β1组：t=10.817和7.522，P=0.000；MRC-5细胞20μg/L TGF-β1组：t=16.295和19.745，P=0.000），15和20μg/L TGF-β1组α-SMA和胶原Ⅰ的表达＞0μg/L，表明15μg/L TGF-β1作用24 h后，肺成纤维细胞成功转化为肌成纤维细胞。

2.2 TRPM7在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞转化模型中高表达

用15μg/LTGF-β1分别刺激WI-38和MRC-5细胞24h，诱导肺成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR）和Western blot检测结果表明，WI-38和MRC-5细胞的模型组与对照组比较，差异有统计学意义（WI-38细胞TRPM7 mRNA：t=13.825，P=0.000；WI-38细胞TRPM7蛋白：t=27.500，P= 0.000；MRC-5细胞TRPM7 mRNA：t=24.316，P= 0.000；MRC-5细胞TRPM7蛋白：t=24.084，P=0.000），模型组中TRPM7 mRNA和蛋白表达量高于对照组（见图2）。

图2 Real-time PCR和Western blot检测TRPM7在WI-38和MRC-5细胞中的表达

图3 qPCR和Western blot检测TRPM7 siRNA对WI-38和MRC-5细胞TRPM7表达的影响

2.3 TRPM7 siRNA抑制WI-38和MRC-5细胞中TRPM7的表达

转染TRPM7 siRNA 48h后，用15μg/L TGF-β1刺激WI-38和MRC-5细胞24 h，TRPM7 mRNA和蛋白表达见图3。模型组和对照组TRPM7 mRNA和蛋白表达量，差异有统计学意义（WI-38细胞TRPM7 mRNA：t=33.918，P=0.000；WI-38细胞TRPM7蛋白：t=26.774，P=0.000；MRC-5细胞TRPM7 mRNA：t=23.729，P=0.000；MRC-5细胞TRPM7蛋白：t= 26.855，P=0.001），模型组TRPM7表达高于对照组。模型组、Scramble组及TRPM7 siRNA组的TRPM7 mRNA和蛋白表达量，经方差分析，差异有统计学意义（WI-38细胞TRPM7 mRNA：F=264.277，P=0.000；WI-38细胞TRPM7蛋白：F=205.178，P=0.000；MRC-5细胞TRPM7 mRNA：F=184.192，P=0.000；MRC-5细胞TRPM7蛋白：F=248.786，P=0.000），其中siRNA转染组TRPM7 mRNA和蛋白表达量与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（WI-38细胞：t= 17.870和19.314，P=0.000；MRC-5细胞：t=17.275和23.016，P=0.000），siRNA转染组TRPM7 mRNA和蛋白表达量低于模型组。

2.4 TRPM7 siRNA对TGF-β1/Smad信号通路相关基因表达的影响

WI-38和MRC-5细胞模型组与对照组比较，差异有统计学意义（WI-38细胞Smad3：t=6.604，P=0.003；WI-38细胞p-Smad3：t=8.486，P=0.001；WI-38细胞Smad7：t=7.977，P=0.001；MRC-5细胞Smad3：t= 6.154，P=0.004；MRC-5细胞p-Smad3：t=5.317，P= 0.006；MRC-5细胞Smad7：t=8.341，P=0.001），模型组Smad3和p-Smad3的蛋白表达高于对照组，Smad7蛋白表达低于对照组。模型组、Srcamble组及TRPM7 siRNA组的Smad3、p-Smad3和Smad7蛋白表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（WI-38细胞Smad3：F=42.020，P=0.000；WI-38细胞p-Smad3：F=31.000，P=0.000；WI-38细胞Smad7：F=40.327，P= 0.000；MRC-5细胞Smad3：F=22.373，P=0.002；MRC-5细胞p-Smad3：F=60.928，P=0.000；MRC-5细胞Smad7：F=50.683，P=0.000）。TRPM7 siRNA可下调肺成纤维细胞中Smad3和p-Smad3的蛋白表达，上调Smad7蛋白表达（WI-38细胞：t=7.949、8.141和8.283，P=0.000；MRC-5细胞：t=8.283、9.354和9.125，P=0.000）。见图4。

图4 Western blot检测TRPM7 siRNA对Smad3、p-Smad3及Smad7表达的影响

2.5 TRPM7 siRNA降低α-SMA和胶原Ⅰ的表达

Western blot检测结果显示，WI-38和MRC-5细胞模型组与对照组比较，差异有统计学意义（WI-38细胞α-SMA：t=13.152，P=0.000；WI-38细胞胶原Ⅰ：t=11.631，P=0.000；MRC-5细胞α-SMA：t=11.913，P=0.000；MRC-5细胞胶原Ⅰ：t=12.129，P=0.000），模型组α-SMA和胶原Ⅰ蛋白表达量高于对照组；模型组、Srcamble组及TRPM7 siRNA组α-SMA和胶原Ⅰ蛋白表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（WI-38细胞α-SMA：F=106.364，P=0.000；WI-38细胞胶原Ⅰ：F=107.823，P=0.000；MRC-5细胞α-SMA：F=135.850，P=0.000，MRC-5细胞F胶原Ⅰ：F=118.595，P=0.000）；其中模型组和Srcamble组比较，经LSD-t检验，差异无统计学意义（WI-38细胞α-SMA：t=0.868，P=0.257；WI-38细胞胶原Ⅰ：t=1.348，P=0.708；MRC-5细胞α-SMA：t=0.926，P= 0.327；MRC-5细胞胶原Ⅰ蛋白：t=0.158，P=0.847）。TRPM7 siRNA组WI-38和MRC-5细胞中α-SMA和胶原Ⅰ蛋白表达量与模型组比较，经LSD-t检验，差异有统计学意义（WI-38细胞：t=14.185和 12.396，P=0.000；MRC-5细胞：t=10.339和8.969，P=0.000），表明TRPM7 siRNA组WI-38和MRC-5细胞中α-SMA和胶原Ⅰ蛋白表达量低于模型组。见图5。

图5 Western blot检测TRPM7 siRNA对α-SMA表达和胶原Ⅰ表达的影响

3 讨论

IPF病理表现为细胞外基质蛋白大量沉积及肺成纤维细胞聚集与活化，其发病机制迄今不明。通常被认为是肺成纤维细胞转化为肌纤维细胞并聚集在肺间质，细胞外基质合成增多降解减少，致纤维化的细胞因子表达上调等多因素作用的结果。成纤维细胞在肺纤维化形成过程中扮演着极为重要的角色，其活化是肺纤维化形成的关键步骤和核心环节[10]。在肺纤维化发展过程中，活化的肺泡巨噬细胞或其他细胞分泌的TGF-β1使肺成纤维细胞表型发生转化，为可表达α-SMA、合成大量胶原的肌成纤维细胞[11-12]，而肺间质中的胶原纤维主要由肌成纤维细胞产生。肌成纤维细胞还可造成细胞外基质异常沉积，诱导肺泡上皮细胞凋亡，在肺纤维化疾病发生、发展中发挥至关重要的作用[13]。本实验中，经15μg/L TGF-β1诱导24 h，α-SMA和胶原Ⅰ蛋白合成显著增高，表明肺成纤维细胞成功向肌成纤维细胞转化。

TGF-β1/Smad信号通路在肺纤维化过程中起重要作用[14-16]。TGF-β1是TGF-β1/Smad信号通路中一个重要的调控因子，也是促肺纤维化的关键因子[11]，可促进成纤维细胞过度增殖、分化，向成肌纤维细胞表型转化[17]，继而导致肺间质和肺泡间α-SMA与胶原蛋白等细胞外基质蛋白的过度沉积，最终导致肺纤维化的发生、发展。本实验结果显示，与模型组相比，TRPM7 siRNA可降低肺成纤维细胞中α-SMA和胶原Ⅰ蛋白的表达，表明TRPM7 siRNA通过抑制TGF-β1发挥抗纤维化作用。TGF-β1主要通过Smads信号通路转导，诱导其下游因子表达而发挥致纤维化作用[18]。Smad蛋白既可促进又可抑制TGF-β1信号转导，其中Smad3为TGF-β1/Smads信号通路中主要的活化蛋白，其正常表达是肺纤维化形成所必须的[19]，抑制Smad3或p-Smad3可抵抗TGF-β1诱导的纤维化[20]。而Smad7是TGF-β1/ Smad信号通路中的负调节蛋白，可阻滞Smad3磷酸化。此外Smad7活化可抑制TGF-β1的活性，从而抑制肺纤维化[21-22]。本实验发现，TRPM7 siRNA可通过抑制TGF-β1/Smad信号途径，下调Smad3及p-Smad3表达，上调Smad7表达，而减少肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，表现为α-SMA表达和胶原Ⅰ蛋白合成减少。

TRPM7有阳离子通道和蛋白激酶双重结构，其通过影响细胞内信号转导参与细胞多种生理过程[23]，在调节细胞内离子平衡、促进细胞生长、调节神经递质释放及维持细胞功能等方面具有重要作用[24-25]。TRPM7被认为是纤维化疾病的一个潜在的治疗靶点[26]。本研究发现，TRPM7在TGF-β1诱导的WI-38和MRC-5细胞中高表达。为进一步确定TRPM7在肺纤维化中的作用，用TRPM7 siRNA抑制TRPM7的表达，发现TGF-β1/Smad信号通路受到抑制，WI-38和MRC-5细胞α-SMA和胶原Ⅰ蛋白表达均降低，表明TRPM7 siRNA在抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中发挥关键作用。

综上，本研究证实，TRPM7 siRNA可在一定程度上抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，且该作用与TGF-β1/Smads信号通路有关。干扰TRPM7有望成为防治肺纤维化新的靶点。

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（童颖丹 编辑）

Inhibitive effect of TRPM7 on transformation of human lung fibroblasts to myofibroblasts

Li-hua Li,Bin Lu,Hong-ke Wu,Hao Zhang,Fei-fei Yao
(Department of Respirology,the People's Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou,Henan 450003,China)

ObjectiveTo investigate the effects of siRNA-induced transient receptor potential channel 7 (TRPM7)on differentiation of human fetal lung fibroblasts to myofibroblasts induced by TGF-β1,providing a new target for the prevention and treatment of pulmonary fibrosis.MethodsWI-38 and MRC-5 cells were cultured and stimulated with TGF-β1.The expressions of smooth muscle actin(α-SMA)and collagenⅠwere detected by Western blot for evaluation of differentiation of fetal lung fibroblasts to myofibroblasts.The mRNA and protein expressions of TRPM7 in the cells were detected by real-time PCR and Western blot.The cells were divided into control group,model group,nonspecific transfected group and TRPM7 siRNA group. Western blot was performed to detect the expressions of α-SMA,collagenⅠ,Smad3,p-Smad3 and Smad7, respectively.ResultsWI-38 and MRC-5 cells were successfully transformed into muscle fibroblasts in the presence of TGF-β1(15 μg/L)for 24 h.Compared with the control group,the up-regulation of TRPM7,α-SMA,collagenⅠ,Smad3 and p-Smad3,and the down-regulation of Smad7 were observed in the model group(P＜0.05).Furthermore,the expressions of TRPM7,α-SMA,collagenⅠ,Smad3 and p-Smad3 were remarkably down-regulated in the TRPM7 siRNA group compared with the model group(P＜0.05),while TRPM7 siRNA significantly increased Smad7 level compared with the model group(P＜0.05).ConclusionsTRPM7 siRNA could restrain differentiation of fetal lung fibroblasts to myofibroblasts to some extent,which may be related to the activation of TGF-β1/Smads signal pathway.

transient receptor potential channel 7;pulmonary fibrosis;lung fibroblast;TGF-β1/Smads signaling

R563

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.007

1005-8982（2017）01-0035-07

2016-01-14