雌激素缺乏大鼠根尖周炎病变区HMGB1的表达

关晓月 钱 华 关永晖 古丽努尔·阿吾提

根尖周炎是口腔疾病中常见的细菌感染性疾病，多继发于龋病及牙髓病，其病理主要表现为根尖周病变区牙槽骨炎性破坏[1]。高迁移率族蛋白盒1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种非组蛋白染色体蛋白，广泛分布于真核细胞的细胞核中，调节细胞分化、基因转录等[2]。HMGB1作为一种重要的晚期炎性介质，对维持和延长机体内炎症反应有重要的作用[3]。研究发现，当单核细胞及巨噬细胞受到内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激，可分泌产生有活性的HMGB1，并促其发挥炎症细胞因子的作用[4]。HMGB1可少量表达于正常根尖周组织，然而，在炎症根尖周组织中HMGB1的表达呈强阳性[5]。雌激素对全身骨代谢起着重要作用，雌激素能够刺激成骨细胞制造骨基质；当体内雌激素水平降低时，破骨细胞的数量增多，活性增强，促进骨吸收。雌激素缺乏时，可加剧大鼠根尖周炎病变区炎性骨吸收[6]。近年来，有研究显示，雌激素水平的改变可影响HMGB1的表达[7-9]。然而，当雌激素缺乏时，大鼠根尖周炎病变区炎性细胞浸润及骨破坏程度的加剧，是否与HMGB1的表达变化相关，目前尚未可知。本次实验拟通过建立卵巢去势大鼠根尖周炎模型，观察雌激素缺乏对大鼠根尖周炎模型中HMGB1表达的影响。

1.材料及方法

1.1 材料购置40只12-16周龄，体重200g-220g的健康雌性SD大鼠，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(新)2015-0002。将大鼠随机分为两组，OVX组及SHAM组，每组20只。主要试剂：戊巴比妥钠(Sigma,美国)，Trap试剂盒(Sigma,美国),HMGB1兔抗鼠多克隆抗体(Abcam,美国),二抗SP试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 卵巢摘除术所购置大鼠于同等环境中适应性喂养一周。在两名助手帮助下，向大鼠腹腔内推入0.3%(3ml/kg)戊巴比妥钠行全身麻醉，大鼠取仰卧位固定于手术台，在腰肌与肋缘相交处备皮，常规消毒，纵向切开组织、切除卵巢，彻底止血，缝合。SHAM组仅切除卵巢周围附着的卵巢大小脂肪组织，常规消炎，关闭腹腔。给予术后护理，定期补给饮用水及鼠粮，每日更换垫料。

1.2.2 根尖周炎模型制备及样本处理

卵巢摘除术后一周[10]，行根尖周炎模型制备，麻醉方法同上。大鼠取仰卧位，固定四肢及上颌。使用1/2#球钻对双侧下颌第一磨牙远中窝处开髓，探及穿髓点后即停止，防止底穿，随后将髓腔直接暴露于口腔环境中。髓腔开放后0d、7d、14d、21d时，OVX组及SHAM组均随机挑选5只大鼠，全麻下内眦静脉取血3-5ml，分离下颌骨，脱颈处死。修整下颌骨并清理后，10%EDTA 4℃下缓慢脱钙。二甲苯浸泡，常规梯度酒精脱水，正丁醇透明，石蜡包埋。对标本行颊舌向连续切片，切片厚约5um,以切至第一磨牙远中根根尖孔为标准。对包含下颌第一磨牙远中根尖孔的切片行HE染色、酶组织化学染色、免疫组织化学染色并分析结果。

1.2.3 血清雌激素水平检测 大鼠腹内眦静脉血置入2mlEP管，4℃下，1000r/min离心20min,分离血清，放射免疫法检测血清中雌激素水平。

1.2.4 HE染色 组织学染色时，OVX组及SHAM组于0d、7d、14d、21d时，各选取3个样本，每样本随机选取3张切片行常规HE染色，光镜下观察根尖周骨骨破坏范围及炎性浸润程度。

1.2.5 酶组织化学染色 抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)是破骨细胞特异的生化标志物[11]。各实验分组于0d、7d、14d、21d随机挑选出三个样本。将所选标本置于60℃温箱烤片1h，蒸馏水预热，二甲苯I,II脱蜡，下行梯度酒精脱水，37℃下Trap染液孵育1h，苏木素染色，细胞核返蓝，封片。光镜下观察破骨细胞形态及数目。阴性对照使用PBS。

1.2.6 免疫组织化学染色及分析 各实验分组于0d、7d、14d、21d随机挑选出三个样本。各样本置于二甲苯中常规脱蜡，梯度酒精入水，37℃下胃蛋白酶消化20min,消除内源性过氧化物酶，PBS洗5min×3次，血清封闭，滴加一抗，HMGB1兔抗鼠多克隆抗体 (1∶500)，4℃过夜。滴加二抗，DAB显色，苏木素复染。阴性对照以PBS代替一抗。

1.2.7 细胞计数及统计学分析 OVX组及SHAM组大鼠血清雌激素水平采用Graphpad软件进行统计分析。对于Trap染色及免疫组织化学染色结果，采用双盲法在高倍视野下(400×)随机选取根尖周病变区的5个视野对破骨细胞及HMGB1阳性细胞进行计数，计算平均值。数据均以x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计学分析。各组间比较采用方差分析和t检验，检验水准a=0.05。

2.结果

2.1 血清雌激素水平 SHAM组血清雌激素水平在实验全程中处于较为稳定，无明显改变(-39.89±6.72pg/mL)；行双侧卵巢切除术的OVX组，术后第7d血清雌激素水平急剧降低，14d及21d时OVX组血清雌激素水平较7d组无明显差异，稳定保持在较低水平(-10.36pg±2.10pg/mL)。

2.2 组织学观察 HE染色可观察大鼠实验性根尖周炎模型病变区骨缺损范围及炎性细胞浸润状态。本次实验中，髓腔开放0d时，大鼠下颌第一磨牙根尖周组织结构完整，无炎性吸收及骨破坏。髓腔开放7d时，两组模型根尖周组织可见以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，牙槽骨轻度吸收呈虫蚀状。髓腔开放14d时，两实验组下颌第一磨牙牙髓组织基本全部坏死，根尖周病变区多种炎性细胞浸润加重，牙槽骨吸收较7d时进一步加重。髓腔开放后21d时，根尖周病变区炎症进一步增强，出现以淋巴细胞及中性粒细胞为主的炎性细胞大面积浸润，形成根尖脓肿，牙槽骨吸收于此时达到最大值。本实验中，OVX组大鼠开髓后7d,14d及21d，其根尖周组织炎性细胞浸润程度及牙槽骨破坏范围均较SHAM组显著。

图1 根尖周组织HE染色及酶组织化学染色结果

2.3 酶组织化学染色结果 Trap阳性细胞胞质呈深红色/紫色，胞核呈蓝色。在Trap染色中具有两个或两个以上细胞核的阳性细胞即为破骨细胞。Trap染色结果显示，破骨细胞多分布于根尖周炎病变区骨破坏前沿。两组大鼠开髓后0d,7d,14d及21d时，其根尖周病变区均可见破骨细胞的表达。破骨细胞数目自开髓后0-14d逐渐增多，并于14d时达到顶峰，21d时其数目发生减少。模型建立后0d，7d及14d时，OVX组破骨细胞数目较SHAM组增加显著(P＜0.05)。

图2 根尖周组织酶组织化学染色结果

2.4 HMGB1免疫组织化学染色结果 免疫组织化学染色结果显示，髓腔开放后0d，OVX组及SHAM组大鼠根尖周组织中均可少量表达HMGB1，且HMGB1主要分布于细胞核内，轻微表达于细胞胞浆。大鼠髓腔开放后7d，HMGB1胞核着色的阳性细胞数数目增加，且细胞胞浆对于HMGB1的阳性表达显著升高。开髓后14d,21d时，两组大鼠根尖周炎病变区胞核着色阳性细胞数较7d时减少,但胞浆HMGB1阳性着色持续增多，且于21d时胞浆呈HMGB1阳性着色的细胞数目达到最大值。自根尖周炎模型建立起的7d,14d,21d,OVX组大鼠根尖周炎病变区HMGB1胞浆着色的阳性细胞数显著高于SHAM组，具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 根尖周组织免疫组织化学染色结果(×400)

3.讨论

雌激素在全身骨代谢的过程中发挥了重要作用,雌激素的缺乏可通过调控IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-11,M-CSF,Prostaglandin E(PGE)等细胞因子促进破骨细胞的生成，促进骨吸收[12-15]。本次试验对OVX组进行双侧卵巢切除，通过测量OVX组及SHAM组大鼠血清雌激素水平，判定成功建立大鼠雌激素缺乏模型，OVX组血清雌激素水平约为(-10.36pg±2.10pg/mL),SHAM组约为(-39.89±6.72pg/mL)。组织化学染色发现，随时间推移，OVX组根尖周组织炎性细胞浸润及骨破坏面积均较SHAM组显著。另外，酶组织化学染色结果显示，血清雌激素水平的降低，可促进破骨细胞的形成及功能行使，大鼠开髓后0d、7d、14d时，OVX组根尖周组织破骨细胞数目明显多于SHAM组(P＜0.05)。以上结果与Zhang et al.关于雌激素缺乏对大鼠根尖周炎的作用的描述相一致[16]。

HMGB1作为一种DNA伴随因子存在于多种真核细胞的细胞核中，当机体发生细胞损伤、坏死及炎症时，HMGB1可从细胞核中脱离进入胞质中，发挥其生物学效应[18]。HMGB1与多种促炎因子之间存在相互影响，如采用LPS，IL-1β、TNF-α刺激巨噬细胞及单核细胞时，可促进HMGB1的产生，而当使用HMGB1刺激巨噬细胞及单核细胞，亦可加强IL-1β、IL-6、TNF-α的产生[3,4]。此外,HMGB1的产生及分泌与骨组织改建存在一定联系，破骨细胞及成骨细胞中均可检测到HMGB1的表达[19]。研究人员证实，HMGB1不仅可通过结合RANKL DNA序列上调TNF-α转录，另外亦促使低于阈值浓度的RANKL诱导破骨细胞生成[20,21]。根尖周炎作为口腔常见炎性骨吸收疾病，HMGB1参与了其发生发展过程[5,22]。本文通过免疫组织化学染色观察HMGB1在大鼠根尖周炎病变区的表达，SHAM组大鼠根尖周炎病变区HMGB1的表达结果与贾彤彤等一致[22]，即自开髓后0-21d，大鼠根尖周胞质染色的HMGB1阳性细胞数逐渐增加，于21d时达到最大值。OVX组大鼠于髓腔暴露后7d、14d及21d时，其根尖周HMGB1阳性细胞数较SHAM组明显增高，且具有统计学意义(P＜0.05)，本研究证实雌激素缺乏可增强大鼠根尖周病变区HMGB1的表达。

雌激素对于HMGB1的作用已在研究中得以探讨，Gonda等人发现HMGB1可通过与雌激素受体的结合，增强雌激素效应[23]。此外，使用雌激素刺激雌激素敏感细胞时，可观察到其细胞周期动力学分布异常，同时伴有HMGB1的高表达[7,8]。本文仅通过免疫组织化学染色证实雌激素缺乏可影响大鼠根尖周炎病变区HMGB1的表达，未说明雌激素缺乏是通过何种途径调控HMGB1的表达。此外，大鼠根尖周炎病变区HMGB1表达与其它炎性因子，如TNF-α,IL-1β及IL-6等之间的交互作用亦未得到开展研究。

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