掺钽羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响*

路荣建 贺慧霞 鄂玲玲 张桂兰 宁成云 刘洪臣

钛及其合金是临床最常用的牙种植体材料，具有良好的机械性能和生物相容性。羟基磷灰石凭借较强的生物活性和骨诱导能力，被广泛用作人骨组织替代材料。羟基磷灰石涂层可有效改善钛的生物惰性，提高种植体的骨结合性能力。但是羟基磷灰石机械性能差，且与钛基体的结合力不足，易崩解脱落而影响涂层种植体的远期固位效果，最终导致种植体失败[1]。为此，研究者们致力于改进涂层方法和制备工艺，以提高羟基磷灰石涂层种植体的力学性能。在羟基磷灰石涂层中掺杂无机元素是种植体材料领域的研究热点之一。研究表明掺锶(Sr)[2]、锌(Zn)[3]、镁(Mg)[4]等均能够降低羟基磷灰石涂层的脆性，还可提高涂层-基体的结合强度。多孔钽因其优良的力学和生物学相容性在关节外科取得了理想的临床疗效，表现出良好的应用前景。近年来，钽作为金属植入体的涂层材料引起研究者广泛关注。目前国内外关于掺钽羟基磷灰石涂层的研究鲜有报道。本研究利用大气等离子喷涂技术在纯钛表面制备掺钽羟基磷灰石复合涂层，体外研究表面特征，并评价对骨髓间充质干细胞黏附、铺展、增殖等生物学行为的影响，为新型种植体涂层材料的研制和应用提供依据。

1.材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 钽粉(东方钽业股份有限公司,99.9%,粒径35-75μm)，羟基磷灰石粉(仁邦生物科技有限公司,99.9%,粒径35-75μm)，圆形纯钛片(北京富乐科技有限公司)，扫描电镜(FEI,荷兰)，大气等离子喷涂机(Chemplex,美国)，X射线衍射仪(Shimadzu,日本)，表面轮廓仪(Breitmeier,德国)，万能力学试验机(Instron,美国)，酶联免疫检测仪(Bio-Tek,美国)，DMEM培养基(Gibco,美国)，激光共聚焦显微镜(LSM,德国)，MTS试剂盒(Promega,美国)，Hochest(Sigma, 美国)。

1.2 材料制备及表征 圆形钛片(直径10mm，厚1mm)经丙酮、乙醇和去离子水超声清洗，0.8MPa下Al2O3喷砂处理后作为基体。将Ta和HA混粉球磨4小时，转速为200转/分。等离子喷涂机内将混粉熔融、喷涂至钛基体表面，制备掺钽羟基磷灰石涂层。在课题组研究基础上[5]优化参数，喷涂功率设为30KW，送粉速率为14g/min，距离为110mm，以氩气和氦气作为保护气体。

按钽和羟基磷灰石不同质量比分为：Ta∶HA=8∶2(a 组)，Ta∶HA=6∶4(b 组)，100%HA(c组)，纯钛作为对照(d组)。利用扫描电镜SEM、X线衍射仪、表面粗糙度仪和接触角测试仪分别检测试样的表面形貌、物相组成、粗糙度和表面接触角。

1.3 大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)分离、培养及鉴定 全骨髓贴壁法获取rBMSCs：2周龄SD大鼠脱颈处死，分离四肢骨，剥离附着软组织，切除两端骨骺。在盛有L-DMEM培养基(含双抗及20%胎牛血清)的培养皿内，用1ml注射器(25号针头)吸取培养液快速反复冲洗骨髓腔，至髓腔发白。将培养皿置于37℃、5%CO2的温箱内孵育，每隔2-3d全换液。待细胞长至90%融合时(10天左右)，用0.25%胰酶按1∶2消化传代，培养基重悬细胞，接种培养瓶。取第3代细胞进行表型鉴定。

1.4 细胞粘附能力检测 试样经60Co照射消毒后，置于24孔板。取第4代rBMSCs(2×104个/ml)接种于试样表面，每孔1ml培养基。温箱内分别孵育60、120和180min后，吸弃培养液，PBS漂洗3次去除未粘附细胞。利用4%多聚甲醛原位固定20分钟后，hochest33342染色细胞核。荧光显微镜下，每个试样随机选取5个视野拍照，Pro Plus6.0软件计数细胞。

1.5 细胞形态观察 将第4代细胞悬液(2×104个/孔)接种于各组试样表面，温箱内培养1d后，扫描电镜观察细胞形态。PBS漂洗3次，2.5%戊二醛固定过夜。梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后观察。

1.6 细胞增殖活力检测 将试样置于24孔板，每组各9枚。取第4代细胞(2×104个/ml)接种于试样表面，每孔1ml培养基。共培养1、3和5d后检测细胞增殖活力。每组各取3孔，吸弃培养液，PBS漂洗3次后置于新的24孔板。每孔加入1ml培养基和预温的200μlMTS，于孵箱内孵育4小时，小心吸取上清液转移至96孔板内，用酶标仪检测490nm波长处的吸光度(OD)值。

1.7 统计分析 所有定量数据测量3次取平均值，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析及SNK-q检验各组间差异，P＜0.05认为有统计学意义。

2.结果

2.1 掺钽羟基磷灰石涂层的表征 扫描电镜观察掺钽羟基磷灰石涂层表面形貌(图1)，低倍镜下(500×)涂层表面明显粗糙不平，由不规则的颗粒堆叠形成大量孔隙。随着钽比例的增加，涂层粗糙程度越高。高倍镜下(2500×)观察，熔融和半熔融颗粒相互连接构成不规则的浅碟形坑或孔隙，直径为20-110μm。掺钽羟基磷灰石涂层致密均匀，与基体紧密结合，厚度为100-120μm。

图1 涂层试样表面形貌SEM图

不同掺钽比例的复合涂层的XRD图谱(图2)显示，掺钽羟基磷灰石涂层表面衍射峰主要为Ta和HA，以及少量Ta2O5、TaO2和Ca3(PO4)2非晶相。在大气等离子喷涂过程中，Ta会被空气中的氧化生成TaO2，后者在基体表面又被进一步氧化成Ta2O5。Ca3(PO4)2则是HA在喷涂过程中分解产生。随着掺钽质量比上升，复合涂层的Ta衍射峰逐渐增强，而HA和Ca3(PO4)2的衍射峰越来越弱。

图2 掺钽羟基磷灰石涂层涂层的X线衍射图谱

表面粗糙度仪分析掺钽羟基磷灰石涂层的粗糙度结果如图3所示，复合涂层的粗糙程度明显高于光滑钛和羟基磷灰石涂层，随着Ta混合比的增加，涂层的粗糙度呈增大趋势。

图3 表面粗糙度仪分析试样粗糙度

接触角分析仪测定去离子水(亲水性)和二碘甲烷(亲油性)在试件表面接触角，计算其表面能。由表1可知，掺钽羟基磷灰石涂层接触角最小，表面能最大，纯钛表面能最小。各试件的接触角随钽含量的增加而递增，纯钛表面能最小。相比较纯钛，掺钽羟基磷灰石涂层亲水性更佳。

表1 掺钽HA涂层、HA涂层和纯钛的表面接触角和表面能

2.2 掺钽羟基磷灰石涂层与钛的结合强度测定涂层断裂时作为涂层的结合强度结果见图4，各涂层与钛基体结合强度均良好，掺钽羟基磷灰石涂层结合强度最大，达到30MPa，高出羟基磷灰石涂层(20MPa)约1.5倍。不同掺钽比的复合涂层组间并无统计学差异(P＞0.05)。

图4 掺钽HA涂层、HA涂层与基体的结合强度，对比HA涂层 ＊P＜0.05

2.3 rBMSCs的培养和鉴定 第3代rBMSCs流式分子鉴定(图5)显示，CD90、CD29呈阳性表达，CD34和CD45的表达为阴性，符合BMSCs分子表型。根据分子表型鉴定结果，全骨髓培养法分离的原代rBMSCs符合干细胞生物学特性，可以用于后续实验。

图5 SD大鼠骨髓间充质干细胞(第3代)表面分子表型

2.4 rBMSCs在试样表面的粘附 rBMSCs与试件共孵育60、120和180min后，荧光显微镜观察染色胞核以计数粘附细胞(图6和图7)发现，各材料粘附细胞数目随时间的延长而递增，涂层表面增加更明显。不同检测时间内，涂层试样表面的粘附细胞均显著多于纯钛。掺钽羟基磷灰石复合涂层粘附细胞能力强于单一羟基磷灰石涂层，但差异并无统计学意义。

图6 培养120min后材料粘附rBMSCs的荧光显示图

图7 培养60、12和180min各材料表面粘附细胞数，对比纯钛 ＊P＜0.05

2.5 rBMSCs在试样表面的形态 培养24小时后，扫描电镜观察细胞形态(图8)，低倍镜下见纯钛表面细胞呈类圆形，涂层组细胞呈条索状贴附于材料表面。高倍镜观察(5000×)，纯钛组细胞伸展不足，偶见短而小的伪足。涂层表面细胞呈扁平状密集分布，呈多角形或长梭形，与材料接触面积更大。且伸出大量伪足，粗大的板状伪足牢固地附于涂层表面的孔隙中，伪足之间相互交织连接，复合涂层组尤为明显。

图8 培养24h后，试样表面细胞形态的SEM图

2.6 rBMSCs在试样表面的增殖活性 材料表面细胞增殖活性检测结果，如图9所示，各组试样表面细胞增殖活力呈时间依赖关系。第1d时，羟基磷灰石涂层及复合涂层表面细胞活性高于纯钛组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。第3d开始，涂层组细胞活力均显著高于纯钛组，各涂层组之间无明显差别。第5天时，各组试样表面细胞活性均达到最高值。

图9 培养1、3和5d后，MTS法检测试样表面细胞的增殖活性，对比纯钛 ＊P＜0.05

3.讨论

随着种植牙技术的日趋成熟，人工种植牙已成为牙齿缺失的的首选修复方式。它能够恢复90%以上的咀嚼率，最大程度改善缺牙患者的生活质量。种植体与牙槽骨快速且稳固的骨结合是种植修复成功的前提，其受颌骨质骨量、种植体材料和外形设计等因素的影响[6]。理想的种植体材料应具有良好的生物相容性、机械性能以及骨整合性。钛及其合金是目前应用最广泛牙种植生物材料,而其缺乏生物活性，骨整合率低，难以与骨组织形成强有力的化学结合，影响了种植修复的临床成功率[7]。

羟基磷灰石类似人骨组织的无机成分，可引导周围骨与植入体形成稳定的化学键合[8]。在钛及合金表面构建羟基磷灰石涂层，结合了金属材料良好的力学性能和生物陶瓷的骨结合能力，是提高种植体临床成功率的有效途径。研究表明羟基磷灰石涂层种植体能够刺激骨的再生，显著增强了其中、短期固位效果[9]。但羟基磷灰石脆性大，且与基体结合强度弱,远期临床疗效差。学者们致力于改进涂层技术来改善涂层种植体的力学性能，但效果并不理想。

羟基磷灰石涂层与金属基体结合强度低，主要由于其热膨胀系数不匹配以及热稳定性差[10]。为了缓和两者热膨胀系数失配的现象，通常在其中掺杂热膨胀系数小于基体的无机材料，或改变热处理方式以降低热失配导致的界面残余应力，从而提高涂层与钛基体的结合力。Cho[11]等研究发现掺锆羟基磷灰石涂层的机械强度及其与钛基体的结合力有所提高。Li等[12]将掺锶羟基磷灰石复合涂层种植体植入去势大鼠胫骨内，发现种植体的骨结合速度及强度均有明显提高。另有研究[13,14]证实，掺杂硅和锌能够降低HA晶体的溶解速率，而增强羟基磷灰石涂层骨植入材料的远期固位效果。

钽以亲生物性著称，是一种理想的生物医用材料。特别是多孔钽在关节外科领域取得了显著的临床疗效，被视为可替代钛的新一代生物金属材料[15]。然而钽成本高，加工技术难度大等弊端，限制了其广泛的临床应用。随着加工技术的发展，钽作为种植体的表面涂层材料，逐渐引起研究者们的关注。Balla[16]等采用激光熔覆技术在纯钛表面制备的多孔钽涂层，研究发现多孔钽的表面能和亲水性较好，有利于成骨细胞的黏附和增生长，从而改善了钛的骨整合性。钽的热膨胀系数低于羟基磷灰石及纯钛，作为添加剂可降低热膨胀系数失配导致的界面残余应力，从而增强HA涂层与纯钛基体的结合强度[17]。

我们采用大气等离子喷涂技术，在纯钛表面制备了多孔隙的钽/羟基磷灰石复合涂层。发现复合涂层致密均匀，其粗糙度与钽的混合比呈正相关，这由于钽和羟基磷灰石不同的熔点导致。钽的熔点远高于HA，在相同的喷涂功率下，未完全熔融的Ta连同几乎完全融化的羟基磷灰石，被高速喷射到纯钛基体表面。复合涂层的粗糙度高于HA涂层，亲水性优于钽涂层，而结合强度较HA涂层有了明显提高。钽的热膨胀系数为(6.5×10-6/K)，小于钛(8-9×10-6/K)以及羟基磷灰石的(13.6-15×10-6/K)，缓解了羟基磷灰石和钛热膨胀系数的急剧变化，使涂层/基体界面的残余应力降低，复合涂层与钛的结合强度得到了显著提高。另外，钽、羟基磷灰石和钛在高温下的化学结合，也可能提升复合涂层/基体的界面结合力。

细胞在种植体表面的生物学行为受表面形貌、粗糙度、亲水性以及表面能的影响[18]。种植体与骨的整合始于骨祖细胞的早期粘附、丛集，是胞外基质和粘附因子通过信号通路介导的复杂程序[19]。多孔隙结构类似天然骨，有利于骨组织的修复再生[20]。Cipriano[21]等认为微米孔隙有利于成骨细胞在种植体表面的粘附。学者[22]在钛表面制备多孔隙结构，能促进间充质干细胞粘附，有利于种植体的骨结合。我们发现复合涂层粘附BMSCs的能力明显强于纯钛，与羟基磷灰石涂层涂层的差异无统计意义。这可能由于多孔复合涂层更容易吸附蛋白，如纤连蛋白和玻连蛋白等促细胞粘附因子[23]。相关的研究及其机制将在后续实验中进行验证。此外，掺钽羟基磷灰石涂层较高的细胞粘附能力还与其良好亲水性有关。

细胞形态与细胞功能密切相关，据报道间充质干细胞的伸展程度与其分化能力呈正[24]。微丝是细胞骨架的重要组成部分，其主要成分是肌动蛋白，与维持细胞形态和细胞黏附有关[25]。本实验中掺钽羟基磷灰石涂层的骨髓间充质干细胞充分伸展，并且伸出粗壮的伪足,细胞骨架排列有序，微丝致密粗大，说明细胞在复合涂层表面的粘附力强。

细胞增殖是基本生理活动，粗糙表面有利于成骨细胞的增殖及胞外基质蛋白表。Teixeira[26]等发现成骨细胞在大孔隙(312μm)表面的增殖活性高于较小孔隙(62μm)。学者们认为纳米及微纳结构更有利于细胞的铺展和增殖[27]。本研究中，rBMSCs在掺钽羟基磷灰石涂层的增殖能力明显强于纯钛，这与以往实验结果一致[28]。细胞增殖活力随时间而逐渐增强，Ta8HA2组变化尤为明显。总体来说，掺钽羟基磷灰石复合涂层促进rBMSCs的增殖活性。

4.结论

掺钽羟基磷灰石复合涂层均匀致密，具有较高的粗糙度和亲水性。相比羟基磷灰石涂层，其与钛的结合强度显著提高，改善羟基磷灰石涂层的机械性能。体外实验表明，掺钽羟基磷灰石复合涂层能够促进骨髓间充质干细胞的粘附和增殖活性，具有良好的细胞相容性。

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