植物油DNA的高效提取方法

□ 刘锦鹤 沈阳食品检验所

植物油DNA的高效提取方法

□ 刘锦鹤 沈阳食品检验所

本文优化高效提取植物油中DNA的方法，以市场上日常可采购的食用植物油为实验原料，并利用多种检测方法评价优化的硅膜吸附柱法提取效率。结果显示，经过优化后的提取方法具有可靠的提取质量，提取效率高，便于后续植物油基因检测工作的良好开展。

植物油；DNA；提取方法

近年来，食品安全问题越来越得到社会各界的关注与重视，尤其是人们每天接触的食用植物油。近年来，转基因原料滥用、原料掺假、地沟油违法使用等方面的问题频发，在鉴定检测中，就逐渐突显出分子生物学检测的重要作用。检测食用植物油的DNA时，首要工作是将其中的DNA提取出来。然而，由于食用植物油生产加工过程中采用的工艺使其中的核酸发了生严重降解，DNA含量极低，再加上混杂多种其他成分，更增加了DNA提取的难度。尽管国内外提出了众多提取食用植物油DNA的方法，但大多操作繁琐、提取效率低、无法实现通用。所以，积极构建能够避免这些问题的高效提取方法，在实际检测过程中是急需解决的问题。

1 植物油DNA高效提取方法概述

近年来，掺假植物油、转基因作物制成的植物油较多出现在消费市场中。植物油掺假不仅会影响消费者的身体健康，而且也会严重损害及侵犯消费者的利益及权利。2015年，颁布实施的《食品安全法》更加要求所有以转基因产品为原料生产加工的食品必须在包装上有明确的标识[1]。基于此种现状，本文以非转基因大豆、转基因大豆、市售食用植物油为研究材料，分析硅膜吸附柱法对提高植物油DNA的提取效果的可行性。

本文使用的非转基因大豆、转基因大豆均来源于农科院；食用植物油购买于超市中，共涉及5个品牌11种产品，其中分别为深海鱼油调和油（转基因）、谷维多稻米油、食用调和油（转基因）、菜籽油（转基因与非转基因2种）、天然谷物调和油（转基因）、一级大豆油（转基因）、压榨玉米油（非转基因）、一级大豆油（转基因）、食用调和油（转基因）和有机压榨大豆油（非转基因）。

1.1 提取方法

利用硅膜吸附柱法提取植物油DNA过程中，使用的试剂主要包含CTAB缓冲液、MgSO4、TE缓冲液、70%乙醇和Taqman DNA聚合酶等；利用离心柱、水浴锅、电泳设备等实验仪器开展。

将1 mL食用植物油、400 μL TE缓冲液共同加入1.5 mL离心管中，经5 min颠倒混匀后，室温下12 000 r/min离心1 min。上层油脂层去除后，再次将1 mL食用植物油加入离心管中，离心，上层油脂层去除，此过程共重复20次，富集待测样品中的DNA。DNA提取采用水相，CTAB缓冲液400 μL加入其中，进行1～3 s振荡提取，30 min温育，温度65 ℃，之后将500 μL异丙醇、2 μg鲑鱼精子DNA均加入，混匀后放置2 h，温度-20℃。于硅膜吸附柱中加入上述所有溶液，离心1 min，速度8 000 r/min，收集管中废液去除，500 μL 70%乙醇（事先经4 ℃预冷）加入吸附柱中，再离心1 min，速度12 000 r/min，收集管中废液去除，重复洗涤1次。液体挥干在室温下进行，或放置在核酸真空干燥系统中进行。吸附柱去除，于干净离心管中放置，30 μL TE缓冲液（事先预热，温度65～70 ℃）加入吸附膜中间，溶解DNA，保存条件为4 ℃。

1.2 检测DNA提取结果

采取普通PCR法、恒温LAMP法、实时荧光PCR法分别检测提取的DNA，各检测方法在检测过程中严格按照操作步骤进行，并观察对比检测结果。

2 硅膜吸附柱法提取植物油DNA结果评价

利用普通PCR法、恒温LAMP法、实时荧光PCR法检测其提取结果时，分为两个方面：①内源基因的PCR扩增，食用植物油DNA经吸附柱法富集提取之后，二次进行内源基因PCR扩增，内源基因包含大豆内源Lectin、玉米内源Adhl、水稻内源SPS、油菜内源HMG I/Y，检测DNA的提取效果。扩增产物的凝胶电泳分离条带结果显示，待测样品均具有清晰的目的基因条带，其中出现两种内源基因条带的有4种植物油，分别为天然谷物调和油、两个品牌的食用调和油、深海鱼油调和油，扩增条带分别为内源基因Lectin、HMG I/ Y；②外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子、EPSPS等外源基因的检测，食用植物油DNA经吸附柱富集提取之后，二次进行外源基因PCR扩增，以扩增条带为依据，对植物油检测结果做出定性判断，观察其中是否含有转基因成分。扩增产物的凝胶电泳结果显示，目的基因条带在转基因大豆、天然谷物调和油、两个品牌的一级大豆油、两个品牌的食用调和油、深海鱼油调和油和转基因菜籽油样品中均出现，说明转基因成分包含在这7种产品中。

本研究采取硅膜吸附柱富集处理提取食物植物油的DNA，通过利用核酸在水相中的溶解度远大于有机相的原理，有效提高裂解液中萃取到的核酸。并利用普通PCR法、恒温LAMP法与实时荧光PCR法检测提取的植物油产品DNA，无论是各种作物的内源基因，或是转基因作物的外源基因，均能获得清晰的目的基因条带[2]。但是增加富集处理步骤，大大延长了提取时间。因此，在后续的工作中还需要进一步研究调整，以期在不影响提取结果的前提下，尽量减少富集处理次数。

3 结语

本研究实验结果显示，硅膜吸附柱对提取植物油DNA的提取效率及可靠性均比较好，样品转基因检测结果与食用油的转基因标识一致，可以在转基因成分分析中广泛应用。

[1]王鸣秋，刘艳，杨硕，等．几种食用植物油DNA提取方法效果比较[J]．食品安全导刊，2017(9)：154-156．

[2]齐玲 ，刘秀，丁梦 ，等．植物油DNA提取和基因检测研究进展[J]．食品研究与开发，2016(1)：220-224．