RNAi技术在转基因西瓜抗病毒病上的研究与应用

李基光，张 屹，肖姬玲，朱菲莹，梁志怀

（湖南省农业生物技术研究中心，湖南 长沙 410125）

西瓜果实汁多味美，且含有丰富的维生素、糖分等，具有解暑、利尿及降血压等功效，深受广大消费者的喜爱。西瓜病毒病作为西瓜3大主要病害之一，在西瓜生产上的危害日趋严重。尤其是近年来西瓜病毒病危害复杂化，多为几种病毒同时侵染，症状表型不再单一化，使得西瓜病毒病的防治工作的难度增大，在很大程度上制约了西瓜产业健康发展。

因此，有效防控西瓜病毒病，减少病毒危害，提高产量及品质，是促进西瓜产业健康发展的重中之重。寻找一种新的有效的防控方法，是西瓜生产上亟待解决的关键问题之一。而RNAi技术的广泛应用，尤其是在植物抗病上的应用，为西瓜病毒病的防治提供了新的思路和方法。

1 RNAi技术概念及研究进展

RNAi是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是生物体内的一种通过双链 RNA（dsRNA）分子使特异性序列的 mRNA发生降解而导致基因表达沉默的过程。该机制广泛存在于真核生物中[1]，由dsRNA、RNA病毒和同源的转基因等诱导产生的一种特定序列的RNA降解机制，其过程包括沉默启动、传导和保持3个阶段。RNAi现象的发现及其普遍性，以及生物学功能、作用机制的初步阐明，为 RNAi的广泛应用提供了理论基础[2]。

目前，RNA沉默已经广泛应用于植物抗病和基因功能等方面的研究。

RNAi 的应用主要是将病毒基因片段转入寄主，使寄主具有抗病毒特点。依据病毒来源的dsRNA 可以激活和诱发植物体内的基因沉默系统抵抗病毒侵染这一理论，人们设想构建病毒基因同源序列的双链结构，导入植物体内用于防御病毒的侵染，从而得到高抗病毒的植株[3]。

近年来，已有一些研究小组开始利用RNAi机制来进行植物病毒分子免疫调控技术研究。1998年WATERHOUSE等[4]研究发现含有马铃薯Y病毒（Potato virus Y ，PVY）正向和反向Pro蛋白的转基因烟草约45%对PVY有免疫作用。并发现植物中的RNAi能被自我互补的发夹RNA（hpRNA）或编码dsRNA所诱导，并首次证实dsRNA的形成是植物基因沉默的起始关键步骤，并提供了设计hpRNA的研究方向。人为设计hpRNA这种类型的遗传结构，导入植物以后能转录产生发夹RNA，启动植物体内的RNAi，最后降解与双链同源的内源mRNA和发夹RNA的双链区。

2 西瓜病毒病的危害及其发生特点

2.1 危害

西瓜病毒病，又称花叶病、小叶病，全国各种植区均有发生。其危害严重，我国每年因西瓜病毒病造成的损失占比30%以上，部分地区甚至绝产。南北方病害发生的特点不一样，南方瓜区多以蕨叶型病毒病为主，北方瓜区多以花叶型为主。在设施长季节栽培中后期发生为多，且受害最重。经过长期实践证明，西瓜病毒的危害程度与蚜虫发生数量和种子带毒率等原因密切相关。

根据主要表现症状可将西瓜病毒病分为花叶型、黄化型、蕨叶型、皱缩型、叶脉坏死型和混合型等5类。在大田生产中，西瓜受危害表现症状类型复杂，多数为几种病毒病同时侵染，常伴有花叶、卷叶、疱斑、线形叶、皱缩、黄化、褪绿等综合症状[5]。

2.2 发生特点

病毒可潜伏在西瓜种皮、蚜虫体内、杂草或某些作物的宿根上（设施栽培中某些设施也是病毒的潜伏点）越冬，翌年在合适的条件下侵染、危害作物。西瓜病毒病在西瓜生育期的各个时期均有可能发生，其中苗期至开花期容易感病，夏、秋季由于大气干旱、气温高等因素易爆发。有研究表明蚜虫与病毒病的发生有着密切的关联，蚜虫的爆发是发病的主要原因之一，每年的5月以后，随着气温日趋变暖，蚜虫、蓟马等的繁殖、迁飞活动频繁，加快了病毒的传播。另外病毒病可通过伤口传播，比如农事操作不当或过勤，造成植株太多的伤口，会增加病毒病的发生率。当遇到连续晴热干旱、持续高温，且瓜地通风不畅、缺水时，病害发生会比较严重。

3 RNAi技术在防治西瓜抗病毒病上的研究与应用

近年来，随着基因工程技术的不断发展，RNAi技术在植物抗病毒方面的研究与应用也越来越多，在西瓜抗病毒病上的研究也取得了一些进展。

3.1 RNAi技术抗西瓜单一病毒的研究

20世纪90年代，黄学森等[6]将WMV的CP基因成功导入西瓜植株，获得一些抗性材料，经检测，对西瓜WMV的发生具有一定的抑制作用。王慧中等[7]将 WMV的 CP基因转入西瓜，获得了抗 WMV的纯合系。PARK等[8]将黄瓜绿叶斑驳病毒CP基因的cDNA转化到西瓜中，经分子检测及抗性鉴定，获得的转基因材料抗黄瓜绿叶斑驳病毒。孙玉宏等[9]利用包含双元载体农杆菌转化西瓜子叶外植体，获得具有抗性的转基因植株。Çürük[10]等将ZYMV-CP基因构建反向重复植物表达载体，获得具有抗ZYMV病毒的转基因西瓜新种质。HUANG等[11]利用农杆菌介导法将含有西瓜银色斑驳病毒的核蛋白基因（WSMOVN）转入西瓜，获得了抗病毒的转基因植株。

3.2 RNAi技术抗西瓜多种病毒的研究

随着气候的变暖，长期连作等原因，西瓜在大田生产中，常常同时遭受多种病毒的侵害，其中主要有西瓜花叶病毒（WMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）和西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）等，因此单一病毒的转基因抗病材料，在生产上难以取得明显的防治效果。因此，如何提高大田生产中病毒病的防治效果，同时抗多种病毒病的研究成为热点与重点。美国 Asgrow种子公司，采用基因工程技术，将小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒和西瓜花叶病毒，这3种病毒的CP基因成功转入西葫芦植株，获得了抗这3种病毒病的西葫芦品种[12]，并已获准上市。吴会杰等[13]针对危害西瓜的主要病毒（CMV、ZVMV、WMV），构建3价植物表达载体，转化西瓜，获得再生植株，经筛选，获得抗性植株，经检测与鉴定，转基因西瓜可同时抗3种病毒。LIN等[14]将4个病毒外壳蛋白基因片段导入西瓜，经检测，转基因植株可以抗多种病毒。

4 结语与展望

RNAi技术在植物中的广泛应用，使得人们对作物的生长发育现象有着更深入完整的认识和了解，从而加快了RNAi技术在作物抗病毒病上及育种上的应用，但RNAi技术在西瓜抗病毒病上的研究存在一些问题。一是倍性不易控制，易发生改变。有研究报道组织培养操作能提高材料的自然加倍率[15]，比如以二倍体西瓜为受体，经过组织培养操作后，部分植株表现出四倍体西瓜的特性。二是菌株和载体的选择。对同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同，选择受体植物敏感的菌株及载体是转化成功的重要因素之一[16]。三是外植体的类型确定。西瓜的多种组织（茎段、原生质体、叶盘等）可作为外植体进行遗传转化，能产生愈伤组织，但都难以形成再生植株。因此，选择适合的转化受体很重要，是转基因操作取得成功的关键因素之一。四是目前由于缺乏良好的转基因食品安全评价体系，人们受传统观念的影响等原因，使得转基因作物在大田推广及应用中存在一定的难度。

这些问题，在一定程度上制约了转基因西瓜抗病毒病的研究与发展。相信随着科技的进步，RNAi技术的不断完善与发展，它将会出现新的更广阔的应用前景。

[1]ALVARADO V, SCHOLTHOF HB. Plant responses against invasive nucleic acids：RNA silencing and its suppression by plant viral pathogens[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology,2009,20(9):1032-1040.

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[3]李基光,王三文,张德咏,等.RNAi技术的研究及其在植物上的应用[J].安徽农业科学,2010,38(8):3897-3899.

[4]WATERHOUSE P M, GRAHRN M W, WANG MB.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1998,95(23):13959-13964.

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[13]吴会杰,刘丽锋,彭斌,等.西瓜抗病毒RNAi植物表达载体的构建[J].果树学报,2009,26(4):525-531.

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[16]赵小强,牛晓伟,范敏.农杆菌遗传转化西瓜的影响因素及应用研究进展[J].浙江农业学报,2016,28(1):171-178.