红色毛癣菌基因分型技术研究进展

程本霖 朱敏

(复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040)

·综述·

红色毛癣菌基因分型技术研究进展

程本霖 朱敏

(复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040)

红色毛癣菌是皮肤癣菌中最常见的致病菌，可引起皮肤浅部的各种癣病，也可引起皮肤的深部感染，甚至多器官的播散性感染。红色毛癣菌形态多样，且不稳定，其所致疾病容易反复发作，临床上治疗往往非常棘手。对红色毛癣菌进行基因分型可以有助于解答复发和再感染的问题，也可从分子水平阐明疾病的流行传播情况，对疾病的预防和治疗具有重要的意义。本文试对红色毛癣菌基因分型技术的进展进行概述。

红色毛癣菌；基因型；分型技术

红色毛癣菌是最常见的浅部致病真菌，可侵犯皮肤角质层、毛发和甲板，导致各种癣病，也可侵犯皮下组织引起Majocchi肉芽肿、蜂窝状毛囊炎、足菌肿、脓肿、疣状增生，甚至血源性播散等多种类型的深部感染[1-3]。红色毛癣菌引起的感染易反复发作，对红色毛癣菌进行种内分型研究可以帮助解答“再感染”或“复发”的问题；也可以了解基因型与菌落特征、药物敏感性或毒力之间的关系，从而发现其表型与基因型间的相互关系；还能有效地帮助评估菌株在种群中的消长，了解其流行病学特征，追踪传染源，防止爆发感染。目前，临床上对于红色毛癣菌的分型以形态学特征为主，极易造成主观上的判断错误，表型与临床的相关性极不稳定，分辨率有限。随着分子生物学技术的飞速发展，基因分型是近年来重点探索的红色毛癣菌种内分型方法，各种技术不断出现。本文试对红色毛癣菌基因分型技术作一综述。

1 基于线粒体DNA (mtDNA)分析技术

线粒体DNA (mtDNA)在细胞核外，与细胞核DNA一样具有特定的基因型。与基因组DNA相比，mtDNA分子相对要小，常常被用于皮肤癣菌系统发育及鉴别的研究。de Bièvre等[4]利用限制性片段长度多态性 (RFLP)分析，将纯化得到的mtDNA进行酶切，将红色毛癣菌分为两群 (Ⅰ和Ⅱ)，然而发现分型与菌落形态的差异或与菌株地理分布并无关联性。Nishio等[5]将内切酶增至5种 (HaeⅢ,MspⅠ,Hind Ⅲ,XbaⅠ及BglⅡ)，所得到的结果与前相同，可分为两群。与其他菌种的mtDNA比较，红色毛癣菌Ⅰ型的mtDNA酶切图谱与Arthrodermabenhamiae遗传关系相近，而Ⅱ型的mtDNA酶切图谱与断发毛癣菌及须癣毛癣菌goetzii变种基本一致，这说明传统的红色毛癣菌分类并不能反映在遗传学上的真实地位。但必须注意的是，线粒体有自己独立的基因组,与细胞核内的DNA在分子量、碱基的比例及序列均不相同。因而mtDNA的分析尚不能全面体现总基因组的特征，而且mtDNA片段较小，其限制酶切位点也较少。因此，mtDNA-RFLP分析对某些种属关系较为相近的皮肤癣菌要比种属关系较远的分辨率低[6]。

2 随机扩增多态性DNA (RAPD)

随机扩增多态性DNA (randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)技术利用合成随机排列的寡核苷酸单链为引物，在宽松条件下，通过PCR反应扩增基因组DNA，扩增后的DNA片段经凝胶电泳后显影，而显示特异性条带 (fingerprint)。Baeza等[7]使用随机引物primer1 (5'-GGTGCGGGAA-3')和primer6 (5'-CCCGTCAGCA-3')对67株红色毛癣菌模板DNA进行扩增，电泳后分别显示出12种及11种带型。成晓茹等[8]利用自行设计的5对随机引物，将46株源于三地不同表型的红色毛癣菌分为5种亚型。然而，并未发现其基因型与表型的相关性。RAPD非常适合在缺少基因组相关信息时使用,此法敏感、快速，但受限于PCR条件，对引物、模板浓度、退火温度、模板DNA品质有较高的要求，且重复性较差。

3 限制性片段长度多态性 (RFLP)

RFLP除了用于上述的mtDNA外，更多用于基因组DNA。只要内切酶合适，此法除了在种间水平进行鉴定外，还可用于菌株种内分型研究。Jackson[9]将红色毛癣菌临床分离株DNA利用内切酶EcoR I进行酶切后，再与红色毛癣菌特异性探针用DNA印迹方法进行杂交，将50株红色毛癣菌临床分离株分为14型 (A～N型)，其中A～D型占78%，未发现表型、致病部位、地区与基因型的关联性。国内李乔等[10]用上述方法，将49株临床分离菌株分为20型 (A～T型)，A～C型占48.98%，推测A～C型可能致病性较强，但有待进一步证实。

4 基于红色毛癣菌核糖体rDNA非转录区 (NTS)的基因分型

上述提及Jackson等[9]利用了内切酶EcoR I酶切消化后，再用特异性探针进行DNA印迹杂交 (Southern blotting)，发现红色毛癣菌基因多态性存在于rDNA的非转录区 (NTS)中。测序后发现，NTS存在着两个串联重复序列TRS-1与TRS-2。故先利用NTS区的特异性引物 (25SCON2、NS1-R)扩增出NTS作为模版，再各自利用TRS-1及TRS-2区的特异性引物 (TrNTSF-2、TrNTSR-4和TrNTSF-2、TrNTSR-4)扩增出TRS-1及TRS-2。结果TRS-1的PCR指纹图可分为3型，TRS-2可分为两型。Baeza等[7]也得到同样结果。之后Jackson[11]结合TRS-1及TRS-2指纹图，将101株红色毛癣菌分为23种基因型。国内李民等[12]也利用上述方法，将20株红色毛癣菌临床分离株分为4种基因型。这是由于NTS区进化速率最快，同一菌种内不同株之间碱基序列可以见到差别。

5 微卫星多态性分析

微卫星多态性 (microsatellite polymorphism)分析又称为简单序列重复 (simple sequence repeat，SSR)分析，是近十年来发展完善起来的一种新的分子遗传标记技术。微卫星由约1～6个bp为重复单位所组成的短的串联重复序列。最常见的是双核苷酸重复，也有少量是三或四核苷酸为重复单位，一般重复10～60次。这种多态性是由于核心重复单位不同以及重复次数不同而形成的长度多态性。在核心序列的两端侧翼是相对保守的序列，可利用这些保守序列设计引物并进行PCR扩增分析。多位点微卫星分析 (multilocus microsatellite typing,MLMT)可用来发现红色毛癣菌菌株的变异，以更好地了解其发病机制、地域分布、流行病学特征等。Ohst等[13]利用微卫星位点 (T1)成功地在130株红色毛癣菌与紫色毛癣菌中找到4个等位基因，分析结果显示红色毛癣菌复合体起源于非洲，后来在亚洲出现一个新的基因型，并随后流行于欧洲大陆及美国。之后Graser等[14]用了22个微卫星位点，把233株红色毛癣菌分为55种基因型，并显示基因型与感染部位及地域起源有一定的相关性。目前MLMT技术多基于荧光毛细管电泳的PCR分型方法，该方法使用测序仪的荧光毛细管电泳代替传统的琼脂糖电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳，分型更加客观准确。

6 PCR解链曲线图形 (PCR-MP)

PCR解链曲线图形 (PCR melting profile,PCR-MP)技术是建立在连接介导PCR (ligation-mediated PCR,LM-PCR)之上的，由鉴定细菌发展而来的方法[15]。PCR-MP其原理是在PCR过程中，在较低的变性温度下，较不稳定的DNA片段 (较低含量的G+C片段)变性，成为模板而被扩增的结果。如今，此技术已被成功地利用于皮肤癣菌及念珠菌的分型[16]。Leibner-Ciszak等[17]用两种限制性内切酶Hind Ⅲ及BamH Ⅰ分析，分别酶切消化了11株红色毛癣菌，再利用PCR-MP方法得到了相兼容的DNA指纹。相比RAPD法，11株红毛中获得了5种基因型(A～E型)，而PCR-MP又从6株RAPD法判为A型的红毛当中分出了亚型A1型，其余的B～E型分别代表了某一分离株。由此可知，PCR-MP得到了比RAPD更高的分辨率。

7 全基因组重测序

近几年来，快速发展起来的全基因组测序 (whole genome sequencing,WGS)技术是一个可以发现在同一种内高度可变区域 (highly variable regions)的方法。2012年，红色毛癣菌及其他4种皮肤癣菌基因组已被完成测序。分析显示，红色毛癣菌及其他皮肤癣菌富含LysM结构域，此域与结合于细胞壁上的几丁质有关。此外，还含有大量二级代谢产物的酶类基因及编码相关激酶的基因，但具体功能尚不清楚[18]。之后，另有10余株红色毛癣菌也被进行了全基因组测序，并且，所有数据均可在NCBI进行共享。全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行基因组测序，并与参考基因组比对，对个体或群体进行差异性分析，如单核苷酸多态性 (SNP)、插入缺失 (Insertion/Deletion，InDel)、结构变异位点 (Structure Variation，SV)、重复序列等。第二代测序技术 (Next-generation sequencing)为边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。相对于Sanger为代表的第一代DNA测序，其通量高、测序时间短，在物种的基因组深度测序上具有优势[19-20]。但其读长短，仍然需要PCR扩增后再检测。以单分子测序为特点的第三代DNA测序技术也已出现，测序过程无需进行PCR扩增，其读长更长、精度更高、结果更快。

8 小结与展望

复习文献，红色毛癣菌的基因分型研究远远落后于其他多种常见真菌，这可能与红色毛癣菌基因组高度保守、低度多样性有关。目前，扩增NTS区内的可变数重复区域或微卫星位点之类的PCR引物方法已经应用于红色毛癣菌基因分型中，但其结果不甚理想，分型技术仍然有很多上升空间。随着DNA测序技术不断地发展以及成本的降低，全基因组重测序将有望应用于红色毛癣菌的种内分型及分子流行病学研究，并将有助于了解菌种的代谢物组、蛋白质组、功能基因组等，从而更好地探索其流行特征、致病机制、抗菌药物靶点等。

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[本文编辑] 王 飞

Research progress on genotyping technology forTrichophytonrubrum

CHENG Ben-lin,ZHU Min

(DepartmentofDermatology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040)

Trichophytonrubrumis the most common one in dermatophytes,not only causing superficial cutaneous tinea but also subcutaneous deeper infections,and even disseminated infections.The morphology ofT.rubrumis varied and unstable.The infection due toT.rubrumis prone to recurrence,a big problem in clinic.Genotyping ofT.rubrumcan help to solve the question of relapse and reinfection,and can also be used to clarify the prevalence of the disease from molecular level.It is of great significance for the prevention and treatment of the disease.This paper is an overview of the progress on the genotyping technology ofT.rubrum.

Trichophytonrubrum；genotype；genotyping technology

62-64]

程本霖，男 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:cblhsyy@126.com

朱敏,E-mail:zhumin3000@hotmail.com

R 379.2

A

1673-3827(2017)12-0062-03

2016-11-28