赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比较研究

陈景明，黄晓冬，蔡建秀，方小玲，陈 玲

（1.泉州幼儿师范高等专科学校，福建 泉州 362000；2.泉州师范学院近海资源生物技术福建省高校重点实验室，福建 泉州 362000）

赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比较研究

陈景明1，黄晓冬2*，蔡建秀2，方小玲2，陈 玲2

（1.泉州幼儿师范高等专科学校，福建 泉州 362000；2.泉州师范学院近海资源生物技术福建省高校重点实验室，福建 泉州 362000）

通过测定1，1-二苯基-2-苦基肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、还原力、金属离子对其抗氧化活性的影响及总酚质量分数等比较赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的抗氧化活性。结果表明：赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位清除DPPH的EC50为0．63、0．10 mg/mL；还原力的EC50分别为0．87、0．09 mg/mL。除Al3+、Fe3+外，K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金属离子对赤楠叶乙酸乙酯部位的DPPH清除作用为抑制作用；除Cu2+、Ca2+外，K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等金属离子对赤楠叶二氯甲烷部位的DPPH清除能力有促进作用。赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的总酚质量分数分别为9．23%与59．17%。可见，赤楠叶乙酸乙酯部位具有较强的抗氧化活性与总酚含量，但其抗氧化活性较易受金属离子的拮抗作用。

赤楠叶；二氯甲烷部位；乙酸乙酯部位；抗氧化活性；总酚

赤楠（Syzygium buxifolium Hook.et.Arn）系桃金娘科蒲桃属灌木或小乔木植物，广泛分布于在我国长江中下游以南省份，资源较为丰富，福建各地极常见[1]。药用记载赤楠根、茎、叶具有健脾、平喘、利湿等功效，根还可治烫火伤，叶可治手指疮[2]，临床报道赤楠对消除肝病蜘蛛痣也有一定疗效[3]，是一种待开发的药源植物。周法兴等[4]从其根茎中分离鉴定出木栓酮、β-谷甾醇、乌苏酸、19-羟基乌苏酸、齐墩果酸及胡萝卜甙等6种化学成分。黄晓冬等[5-9]的研究发现赤楠叶提取物具有较强的抗菌活性，并富含总黄酮。目前尚未见赤楠叶提取物抗氧化性能的研究报道。本文以福建省惠安产赤楠叶为原料，对其醇提取物的二氯甲烷萃取部位与乙酸乙酯萃取部位进行体外抗氧化活性与总酚含量的比较，为赤楠叶提取物作为天然抗氧化剂的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 赤楠叶提取物的制备

赤楠叶采自福建省惠安笔架山，去杂洗净后自然阴干，粉碎成粉末，过孔径178 um（80目）筛，按料液比1∶10（g/L）加入体积分数75%乙醇浸泡7 d/次，浸泡3次。抽滤并汇集浸提液，旋转蒸发仪真空旋转浓缩至无醇味，再以石油醚充分萃取去除叶绿素、脂类、蜡质等非极性成分，再以二氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，获得相应的二氯甲烷部位（DCMF）与乙酸乙酯部位(EAF)。

1.2 赤楠叶提取物抗氧化活性的体外检测

1.2.1 DPPH自由基清除能力的测定

参照陆占国等[10]的方法略加修改。在试管中分别加入样液(以DMSO配制)0.2 mL、4.0 mL质量分数为6×10-5mol/L的DPPH甲醇液，混匀，15 min后于波长517 nm处测定吸光度A1；以等体积的DMSO代替样液，测得吸光度A0；以等体积的甲醇代替DPPH甲醇液测得本底值A2。按下式计算样液对DPPH自由基的清除率C%＝[A0-(A1-A2)]/A0×100%，以2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、维生素C为阳性对照，实验重复3次，结果以平均值±标准差（x-±s）表示。

1.2.2 还原力测定

采用蔡建秀等[11]的测定方法。样液(以DMSO配制)1.0 mL与2.5 mL的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）混合，加入1.0%铁氰化钾2.5 mL，50℃恒温水浴20 min，冰浴冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，离心10 min。离心后取上层清液2.5 mL，加入2.5 mL H2O和2.5 mL 0.1%FeCl3混合均匀，随即700 nm波长测定吸光度，以吸光度对样液浓度作图，拟合方程并求出吸光度为0.500时所对应的样品浓度，作为EC50。以维生素C为阳性对照，实验重复3次，结果以平均值±标准差（x-±s）表示。

1.2.3 金属离子对样品DPPH自由基清除能力影响的测定

参照黄晓冬等[12]的方法。选取样品对DPPH自由基清除率为50%时所对应的样液浓度进行实验，在总体积为5.0 mL的DPPH自由基清除反应体系（0.2 mL样液+4.0 mL DPPH甲醇液+0.8 mL H2O）中加入MnCl2、CuCl2、MgCl2、AlCl3、ZnCl2、KCl、NaCl、CaCl2、FeCl3等金属盐，使体系中金属离子的质量体积浓度为1.0 mg/mL。摇匀混合15 min后，于517 nm波长测定吸光度，同时以甲醇代替DPPH甲醇液测定体系本底值，以不加金属离子为空白对照，求出DPPH自由基清除率并按下式计算影响率/%=(加金属离子后的DPPH自由基清除率－空白对照DPPH清自由基除率）/空白对照DPPH自由基清除率×100%，并以此评价金属离子对样品自由基清除活性的影响。

1.3 总酚含量测定

总酚含量测定采用福林酚法，含量以等量没食子酸（GAE）表示[13]。在1.0 mL样液中加入1.5 mL ddH2O，10倍稀释的福林酚试剂0.5 mL，震荡，待反应物充分混匀1 min后，加入1.0 mL20%碳酸钠溶液，置37℃暗处，使样品充分反应30 min。然后在波长为750 nm处测其吸光度，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位抗氧化活性的比较

2.1.1 DPPH自由基清除率的比较

DPPH自由基是一种人工合成的结构简单且稳定的自由基，由于DPPH自由基清除法反应稳定、现象明显、条件容易控制，因此已广泛应用于各种物质的抗氧化活性评价和筛选。赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位对DPPH自由基的清除作用如图1所示。由图1可知，赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位对DPPH自由基的清除率均随样液浓度增加而增大，具有明显的量效关系。经回归方程分析，计算出赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位与BHT对DPPH自由基清除的半效应浓度EC50分别为0.63，0.10与0.30 mg/mL。可见，赤楠叶乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除明显强于二氯甲烷部位与BHT，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）。

图1 DPPH清除能力比较

2.1.2 总还原力的比较

从氧化还原反应过程看，易被氧化的物质须加入一些比它更易被氧化的化合物作为抗氧化剂发挥抗氧化作用，还原能力越强的物质更易被氧化，因而其抗氧化活性也越强。赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位的总还原力如图2所示。若以吸光度为0.500时所对应的样品浓度作为EC50，测得赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位与Vit C总还原力的EC50分别为0.87，0.09，0.91 mg/mL。赤楠叶乙酸乙酯部位的总还原力显著强于二氯甲烷部位与Vit C（P＜0.05）。

图2 二氯甲烷提取物与乙酸乙酯提取物总还原能力比较

2.1.3 金属离子对样品DPPH清除率影响的比较

分别考察不同金属离子对赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位DPPH清除率的影响，实验结果如图3所示。

图3 金属离子对赤楠叶DPPH自由基清除的影响

由图3可知，9种金属离子对赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位DPPH清除率的影响差异较大，Al3+、Fe3+等金属离子对赤楠叶乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除的影响率分别为55.96%与72.77%，表现为增效作用，但K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金属离子对赤楠叶乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除的影响率分别为-1.80%、13.31%、-1.00%、-1.70%、-10.51%、-80.98%、-2.80%，均表现为抑制作用，其中以Zn2+的抑制作用最强。对赤楠叶二氯甲烷部位DPPH自由基清除率的影响表现为加入Cu2+、Ca2+等金属离子后，DPPH自由基清除率分别由59.52%降为23.03%与55.57%，影响率分别为-61.31%与-6.63%，呈现抑制作用，但K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等金属离子对二氯甲烷部位DPPH自由基清除率的影响表现为增效作用，以Fe3+的增效作用最强，影响率为30.02%。

2.2 赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位总酚质量分数的比较

经福林酚法测定，赤楠叶二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位总酚质量分数分别为（9.23±0.33）%，（59.17±1.02）%。显然，赤楠叶的酚类物质主要集中在乙酸乙酯部位，这或许是乙酸乙酯部位抗氧化活性能力较高的原因。

3 结语

机体中保持一定量的自由基有利于细胞分裂与生长、解毒等，但是当自由基量积累过多时又会导致细胞损伤、凋亡，诱发恶性肿瘤等。正常机体内会通过产生抗氧化物酶来清除与修复过量的自由基，使自由基代谢处于一种动态的平衡[14]，从外界摄入一定量的抗氧化剂也能起到对体内自由基的清除作用。这使得从植物中筛选出安全性、高效性的抗氧化剂或自由基清除剂应用于食品保鲜保存、药品、化妆品等成为研究的热点。本研究发现，赤楠叶乙酸乙酯部位对DPPH有较强的清除作用以及总还原力均明显强于二氯甲烷部位；K+、Na+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等金属离子对乙酸乙酯部位的DPPH清除作用均表现为抑制作用，K+、Mg2+、Na+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Fe3+等对二氯甲烷部位的DPPH清除能力有促进作用。这可能与赤楠叶乙酸乙酯部位总酚物质含量较高有关。酚类物质由于具有酚羟基表现出较高的还原力与自由基清除能力，但一些酚类物质也易与金属离子螯合沉淀而可能影响其生物活性。可见，在开发赤楠叶乙酸乙酯部位作为抗氧化剂时应注意金属离子的不良影响，并注重对其酚类物质的纯化、分离与活性追踪。

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Comparative Study onAntioxidantActive of Dichloromethane Fraction and Ethyl Acetate Fraction from Syzygium Buxifolium Leave

CHEN Jing-ming1，HUANG Xiao-dong2，CAI Jian-xiu2，FANG Xiao-ling2，CHEN Ling2
(1.Quanzhou Preschool Education College；2.FujianAdvanced Education Key Laboratory of Inshore Resources Biotechnology,Quanzhou Normal University,Quanzhou,Fujian 362000,China)

The antioxidant activity of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction of Syzygium buxifolium leaf was compared by measuring of DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical scavenging capacity,reducing power,effects of metal ions on antioxidant activity and total phenolic content.The results showed that the EC50 value of DPPH radical scavenging capacity by dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction from Syzygium buxifolium leaf was 0.63 mg/mL and 0.10 mg/mL,respectively.The reducing power EC50 value of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction was 0.87mg/mL and 0.09 mg/mL,respectively.In addition to Al3+and Fe3+,metal ions including K+,Na+,Mn2+,Mg2+,Cu2+,Zn2+,Ca2+had inhibitory effect to DPPH radical scavenging by ethyl acetate fraction,while metal ions including K+,Na+,Mn2+,Mg2+,Al3+,Zn2+,Fe3+had enhancement effect to DPPH radical scavenging by dichloromethane fraction except Cu2+,Ca2+.Total phenolic content of dichloromethane fraction and ethyl acetate fraction was 9.23%and 59.17%,respectively.These results indicate that ethyl acetate fraction of Syzygium buxifolium leaf has stronger antioxidant activity and higher total phenolic content,but its antioxidant activity may be prone to antagonism of metal ions.

Syzygium buxifolium leaf；dichloromethane fraction；ethyl acetate fraction；antioxidant activity；total phenols

R285.5

A

1673-1891（2016）04-0011-03

10.16104/j.issn.1673-1891.2016.04.004

2016-06-24

泉州市第二批科技项目(2013Z126)。

陈景明（1966—），男，福建泉州人，副教授，研究方向：资源动植物学。*为通信作者。