柱前衍生化高效液相色谱法测定炎宁糖浆中1－脱氧野尻霉素含量

刘琳琳，蔡艳丽，卞艳晶，李正国

（山东省济宁市食品药品检验检测中心，山东 济宁 272025）

柱前衍生化高效液相色谱法测定炎宁糖浆中1－脱氧野尻霉素含量

刘琳琳，蔡艳丽，卞艳晶，李正国

（山东省济宁市食品药品检验检测中心，山东 济宁 272025）

目的建立测定炎宁糖浆中1－脱氧野尻霉素（DNJ）含量的柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为 Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流动相为乙腈－0.1%醋酸溶液（55∶45），流速为1.0 mL／min，柱温为 25℃，荧光检测器激发波长为254 nm，发射波长为322 nm，进样量为10 L。结果DNJ质量浓度在0.104～52 g／mL范围内与峰面积线性关系良好（r＝0.999 9），其精密度、稳定性、重复性均较好，平均回收率为97.66%，RSD＝1.67%(n＝6）。结论该方法准确、可靠，可作为炎宁糖浆中DNJ的含量测定方法。

炎宁糖浆；1－脱氧野尻霉素；柱前衍生化；高效液相色谱法；含量测定

炎宁糖浆收载于2015年版《中国药典（一部）》，由鹿茸草、白花蛇舌草、鸭跖草3味中药提取制成，具有清热解毒、消炎止痢功效，主要用于上呼吸道感染、扁桃体炎、尿路感染、急性菌痢、肠炎等的治疗[1]1107－1108。其主要成分鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草 Commelina communis L.的干燥地上部分，药性寒，味甘、淡，归肺、胃、小肠经，具有清热泻火、解毒、利水消肿功效[1]282。1－脱氧野尻霉素（DNJ）是鸭跖草已知的特征成分之一[2]，为α－糖苷酶抑制剂，具有降血糖功效[3－5]。但制剂标准中除性状、鉴别项外，仅有总黄酮的含量测定项，专属性不强。为此，笔者建立了测定炎宁糖浆中DNJ含量的柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）法，为其质量控制提供了依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－10AD型高效液相色谱仪，RF535型荧光检测器（日本岛津公司）；N2000型双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；0.45 μm微孔滤膜（上海兴亚净化材料厂）；BSA124S型分析天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司）；超声清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司）；微量移液器（大龙仪器公司）；HH型恒温水浴锅（金坛市中大仪器厂）。

1.2 试药

1－脱氧野尻霉素对照品（上海士锋生物科技有限公司，纯度＞98.5%，批号为20150515）；炎宁糖浆（市售，批号为 150908，150915，150923）；芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl，美国Sigma公司）；甘氨酸（美国查特姆公司，纯度＞98%）；乙腈（美国天地色谱试剂有限公司）为色谱纯，纯净水（杭州娃哈哈集团），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0.1%醋酸水溶液（55∶45，V／V）；流速：1.0 mL／min；柱温：25℃；荧光检测器激发波长：254 nm，发射波长：322 nm；进样量：10 μL。

2.2 样品衍生化方法[6]

精密吸取10 μL样品溶液置1.5 mL离心管中，加10 μL硼酸钾缓冲液（pH＝8.5），再加入 5 mmol／L FMOC－Cl的乙腈溶液20μL，混匀，20℃水浴反应20min，再加入 0.1 mol／L的甘氨酸 10 μL，混匀，加 950 μL 0.1%（V／V）的醋酸水溶液，混匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL分析。

2.3 溶液制备

对照品溶液：称取10.4 mg DNJ对照品，精密称定，用纯净水定容至100 mL，得对照品母液。用纯净水将母液稀释成质量浓度为0.104，0.52，3.12，5.2，10.4，31.2，52 μg／mL的系列对照品溶液。再经衍生化处理，即得。

供试品溶液：精密量取本品2 mL，置100 mL容量瓶中，加入15 mL 0.05 mol／L的HCl溶液，超声10 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，再经衍生化处理，即得。

空白溶液：精密吸取纯净水10 μL作为空白溶液。再经衍生化处理，即得。

2.4 方法学考察

专属性试验：精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果，对照品溶液与供试品溶液在相同保留时间有相应色谱峰出现，空白溶液则没有，表明空白无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：分别将 0.104，0.52，3.12，5.2，10.4，31.2，52 μg／mL系列对照品溶液进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标、对照品质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝31 602 X＋5 817.5，r＝0.999 9（n＝7）。结果表明，DNJ质量浓度在0.104～52 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：将3.12 μg／mL DNJ对照品溶液依法连续进样 5次，测定峰面积。结果的 RSD为0.87%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12 h时进样10 μL，测定峰面积并计算平均值。结果的 RSD为0.95%（n＝6），表明DNJ在室温下12 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品，依法制备6份供试品溶液进样测定，并计算DNJ的含量及 RSD值。结果样品中DNJ的平均含量为30.25 μg／mL，RSD为0.82%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品1 mL，共6份，分别加入31.2 μg／mL的DNJ对照品溶液1 mL，依法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算加样回收率及 RSD值。结果见表1。

表1 DNJ加样回收试验结果（n＝6）

2.5 样品含量测定

取3个不同批号的炎宁糖浆，依法制备供试品溶液，并进样测定，记录峰面积，计算样品中DNJ的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

衍生化试剂的选择：参考文献[6－7]，比较了9－FMOC－Cl与6－氨基喹啉基－N－羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）2种衍生化试剂，结果显示，采用9－FMOCCl衍生化的衍生物较为稳定，且与水解物分离良好。

流动相考察：考察了乙腈－0.1%醋酸水（50∶50，55∶45，60∶40）不同流动相比例，其中乙腈－0.1%醋酸水（60∶40）分离效果不理想，而乙腈－0.1%醋酸水（50∶50）峰型较差，故选择流动相乙腈－0.1%醋酸水（55∶45）作为洗脱溶剂，分离度良好。

提取方法考察：分别比较了索氏提取、回流提取及超声提取等提取方法，结果，采用超声提取方法时，操作较简便，对DNJ的提取较完全，故采取超声提取方法对样品进行处理。

提取溶剂和时间考察：试验过程中考察了不同溶剂（55%乙腈，0.05 mol／L HCl，水）分别超声提取10 min的提取率，结果显示，0.05 mol／L HCl作为提取溶剂时提取率最高，故选择其作为最佳提取溶剂。同时，比较了不同超声提取时间（10，20，30 min）对提取率的影响，发现随着超声时间的延长，提取率提高幅度很小，表明不同超声时间对含量的提取无明显影响，故选择超声时间为10 min。

综上所述，采用柱前衍生化高效液相色谱法测定炎宁糖浆中DNJ的含量，方法准确可靠，峰形较好，可用于炎宁糖浆中DNJ的质量控制。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]Kim HS，Kim YH，Hong YS，et al.Alpha－Glucosidase inhibitors from commelina communlis[J].Planta Medica，1999，65（5）：437－439.

[3]梁 明，王 鹏，张会慧，等.1－脱氧野尻霉素的研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（17）：9 222－9 223.

[4]陈玉华，邹凤竹，龙 燕，等.蚕桑中1－脱氧野尻霉素药理药效的研究进展[J].时珍国医国药，2014，25（10）：2 486－2 488.

[5]魏晓蕊.桑叶中1－脱氧野尻霉素的提取纯化及其降血糖活性的研究[D].扬州：扬州大学，2012.

[6]欧阳臻，李永辉，徐卫东，等.高效液相色谱－荧光检测法测定桑叶中的1－脱氧野尻霉素（DNJ）含量[J].中国中药杂志，2005，30（9）：682－685.

[7]谢慧明，吴方睿，杨 毅，等.柱前衍生化高效液相色谱－荧光检测法测定桑叶中的1－脱氧野尻霉素[J].色谱，2008，26（5）：634－636.

Content Determination of 1－Deoxynojirimycin in Yanning Syrup by HPLC with Pre－Column Derivatization

Liu Linlin，Cai Yanli，Bian Yanjing，Li Zhengguo
（Jining Institute for Food and Drug Control，Jining，Shandong，China 272025）

Objective Toestablish a method forthe contentdetermination of 1－deoxynojirimycin in Yanning Syrup by HPLC.Methods The determination was carried out with Kromasil C18column.The mobile phase was acetonitrile－0.1% acetic acid solution（55∶45）.The flow rate was 1.0 mL／min.The column temperature was 25℃.The fluorescence detector was operated at λEX＝254 nm，λEM＝ 322 nm.Results The content of 1－deoxynojirimycin was well linearly related to its peak area in range of 0.104－52 μg／mL（r＝0.999 9）.The RSD of precision，stability and reproducibility tests were all less than 2%.The average recovery of the method was 97.66%，with RSD of 1.67%（n＝6）.Conclusion The method is simple，accurate and stable，and can be used to control the quality of Yanning Syrup.

Yanning Syrup；1－deoxynojirimycin；pre－column derivatization；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)24－0075－03

刘琳琳，女，硕士研究生，主管药师，研究方向为药品检验，（电子信箱）liulinlin20160516＠163.com；李正国，男，博士研究生，主任药师，研究方向为药品检验，本文通讯作者，（电子信箱）1661705638＠qq.com。

2016－08－18)