金纳米粒子对骨科相关细胞增殖与代谢作用的研究进展

林 琛，邢更彦

金纳米粒子对骨科相关细胞增殖与代谢作用的研究进展

林 琛，邢更彦

金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）已在不同的领域表现出了很好的研究与应用前景，如化学、生物与医药等。其中，在骨科学领域亦表现出了独特的生物效能，尤其对骨科学相关细胞的作用，如成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞及人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hMSCs）等。不同直径、不同官能团修饰的AuNPs可以不同程度地影响这些细胞的生物效应表达，同时也可获得细胞内的相关信息。

金纳米粒子；骨细胞；骨科学

纳米科技与纳米技术在许多领域均有着广泛的影响，包括生物医学的应用，如银纳米粒子（silver nanoparticles，AgNPs）、C60（fullerene）、量子点（quantum dots）等。其中金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）尤其令科学家关注，其无毒性，易于合成及良好的生物相容性均优于其他纳米粒子[1]。目前，其在化学、生物、工程与医药方面等已经有了至关重要的应用[2]。例如，AuNPs运载脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）至细胞核的效率是聚乙烯胺的8倍，并且AuNPs已成功地应用于新型癌症的靶向运输治疗方法中。另外，吸附于某些物质上的AuNPs，其表面等离子共振峰会发生红移，利用该性质可对某些物质进行免疫、标定与示踪，同时AuNPs也因其独特的催化效应被关注，作为一种新型的催化剂，在催化氧化反应中可以保持着很高的催化活性[3]。

近期研究表明，AuNPs与骨科学息息相关[4,5]。尤其对与骨科学相关的细胞，如成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞及骨髓间充质干细胞的作用显著。这就要求笔者明确AuNPs进入细胞的方式及其与各型细胞的相互作用。以便对其生物效应有进一步的了解，从而更好应用于生物医学领域。因此，本研究就AuNPs与骨科学相关细胞的相互作用进行了总结与阐述。

1 AuNPs的摄取及对细胞膜的作用

AuNPs要进入细胞发挥其生物学功能，该过程需要越过细胞膜来实现。在过去的几年里，已有实验致力于研究细胞摄取AuNPs的方式与途径[6，7]。研究发现，AuNPs可通过细胞内吞方式或者直接穿透细胞膜进入细胞，带负电荷的AuNPs多以内吞作用进入细胞[8]，然而近乎50%的阳性AuNPs则通过直接扩散进入细胞[9]，细胞内吞可相对稳定的发挥粒子功能，而后者在一定程度上可对细胞膜产生破坏作用，若其带有高电荷密度，在进入到脂质双分子层后可在双分子层边界部分生成孔洞，初期为疏水状，随着孔洞的扩大，逐渐演变为亲水状直至稳定。适宜的孔洞可实现AuNPs的有效运输，若孔洞过大则会导致细胞内外信息交流紊乱，进而减弱或者丧失细胞的功能。可见其表面电性是影响其进入细胞方式的重要因素。除表面电性，多种因素均能不同程度影响细胞对金纳米粒子的摄入，AuNPs的形状，配体结构和化学组成等都能导致其细胞摄入不同程度的改变[10]。

2 AuNPs作用

2.1 AuNPs对成骨细胞的作用 成骨细胞是骨形成细胞，在骨的发生发展、功能的发挥及重建与维护方面有着至关重要的作用[11]。原始成骨细胞拥有很多研究的有利条件，包括研究细胞生长过程中的调控机制，基质矿化作用与细胞分化的关系等。Zhang等[12]利用AuNPs干预初级成骨细胞，运用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（cell proliferation and cytotoxicity assay kit ，MTT）、逆转录定量聚合酶链式反应（quantitative real-timechain reaction，Q-RTPCR）、蛋白免疫印迹法（western blot）及酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的方法评价其与20、40 nm金粒子生物相容性，包括形态学、增殖能力、分化能力、基因与蛋白表达及其潜在的机制。结果发现，AuNPs被成骨细胞所吸收，分布于细胞核周围，但是未观察到细胞形态学的改变。AuNPs可以显著提高成骨细胞的增殖，增强碱性磷酸酶（alkalinephosphatase, ALP）的表达，增加成骨细胞中的钙盐沉积。另外，在金粒子的存在下，骨形态蛋白2（bone morphogenetic protein-2, BMP-2）、Runx转录因子2（Runt-related transcription factor-2, Runx-2）、骨钙素（osteocalcin, OCN）的表达有了显著的上调。值得注意的是，20 nm金粒子对成骨细胞活动的上调能力要显著强于40 nm金粒子。对涉及该过程的信号通路研究发现，AuNPs可以提高细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）的磷酸化及其总数的水平，表明ERK/MAPK通路参与该过程。与张金超等[13]研究类似，其认为AuNPs通过Runx-2，BMP-2，ALP和OCN四种基因之间相互作用，从而刺激成骨细胞系MC3T3-E1细胞的成骨分化。Wang等[14]利用金纳米包裹二氧化钛处理体外培养的成骨细胞，MTT检测其对成骨细胞活性与增殖发现在2 d与4 d时成骨细胞活性是逐渐升高的，且高于对照组。其包裹二氧化钛可通过简单的电化学沉积法提高磷灰石形成能力，促进成骨细胞增殖与细胞粘附。粒子表面成分，粗糙度与细胞接触表明能量可影响细胞对细胞外基质蛋白（如纤维连接蛋白与副纤维连接蛋白）的摄取与合成，这些蛋白是促进细胞增殖的重要物质。

2.2 AuNPs对人骨髓间充质干细胞的作用 人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hMSCs）由于其多向分化能力而被视为可用于人体组织重建的一类细胞。而AuNPs对hMSCs有其独特的作用，尤其对成骨分化的作用明显。已有研究表明，AuNPs能够促进hMSCs的成骨分化[15]，可透过细胞膜附着于细胞质内的细胞器与蛋白，通过传递适当的机械应力来刺激p38/MARK信号通路，该通路是骨形成与骨重建的关键调节器[16]。而且不同尺寸和形状对该过程的影响是不同的。Li等[17]分别研究了金纳米球、纳米星、纳米棒在直径为40、70、110 nm时对hMSCs成骨分化的影响。结果发现，球-40、星-70、棒-70能够显著提高细胞中ALP的表达及钙盐的沉积，上调成骨标记基因的表达，然而棒-40却起到了相反的作用。另外，不同修饰的金纳米其性能的表现也有所不同。Li等[18]用羧基、羟基、氨基修饰AuNPs来干预hMSCs，其中羧基修饰的AuNPs对细胞有显著的影响但这种影响确是矛盾的，一方面，它能够上调hMSCs转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）及成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor 2, FGF-2）的表达，促进细胞的增殖，然而另一方面，抑制了ALP的活性及hMSCs的细胞基质矿化作用，对hMSCs成骨分化产生不利的影响。miR-29b是hMSCs成骨分化的促进因子，然而其在细胞中转运成骨分化信使RNA（Messenger RNA, mRNA）的有效率很低， Pan等[19]用miR-29b缀合15 nmAuNPs，发现15 nmAuNPs能够装载miR-29b，从而有效的集中miR-29b的浓度进入细胞质中。AuNPs进入细胞后，主要附着于细胞内质网中，给予内质网一定的应力强度，类似于机械强度，而骨髓间充质干细胞和成骨细胞的细胞活性是与该强度密切相关的，过强的应力强度可导致细胞的凋亡，而适度的应力强度可促进细胞的生成[20]。

2.3 AuNPs对破骨细胞的作用 破骨细胞是骨组织成分的一种，行使骨吸收的功能，与成骨细胞在功能上相对应，二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用[21]。骨吸收在骨重建中是非常重要的过程，然而，破骨细胞过度表达易对骨组织产生负性影响。研究发现，AuNPs可以在一定程度上抑制骨髓巨噬细胞形成破骨细胞，进而抑制其功能[21]。Sul等[22]用150 nm的AuNPs体外干预小鼠骨髓巨噬细胞破骨分化，结果发现，其能够抑制该分化过程，上调抗氧化剂酶谷胱甘肽过氧化物酶-1（glutathioneperoxidase, GSH-Px1）的表达，同时抑制破骨细胞产生氧自由基，而破骨细胞分化因子（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, RANKL）的刺激与这两种物质的水平息息相关。Kim等[23]探究了AuNPs在生物体内对破骨细胞的影响，利用铂金纳米粒子采用灌胃法处理去卵巢引起的骨质疏松症的小鼠，提高了小鼠的骨密度，降低了破骨细胞的形成，再次验证了AuNPs通过抑制RANKL信号通路来抑制破骨细胞的功能。

2.4 AuNPs对软骨细胞的作用 骨关节炎的发展与软骨细胞的变性密切相关。软骨细胞广泛存在于人体骨与关节的软骨组织中，具有合成和分泌基质与纤维的功能。其中，聚蛋白多糖、2型胶原蛋白是软骨细胞外基质的两个主要组成成分，不仅提供着细胞结构支持，同时也承载着来自外界的机械压力[24]，由于蛋白多糖的亲水性使得软骨细胞具有较高的保水能力，为软骨细胞的生存提供良好的微环境。Hsu等[25]用5 nm的AuNPs与2型胶原蛋白缀合成的复合材料，在不同浓度条件下（0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%或 2.5%）干预软骨细胞后，发现该复合物在低浓度（≤0.5%）时，能够增强细胞的机械性能与抗氧化作用，降低细胞基质中NO的表达量，在0.1%浓度下能够促进细胞的增殖，上调1型胶原蛋白，聚蛋白多糖，Sox9相关基因的表达，但在2.5%浓度下这些基因的表达却是下降的。由此可见，AuNPs对软骨细胞有一定的生物作用影响，而软骨细胞又与骨关节炎的发展密切相关，Dwivedi等[26]利用金纳米颗粒作为硫酸软骨素运药载体干预软骨细胞，发现两者联合与只用硫酸软骨素比较，可见聚糖和胶原成两倍的增加，表明这种联合可以刺激软骨细胞的增殖，增加细胞外基质。该两种物质的表达与细胞中氧自由基的表达密切相关，已有研究表明AuNPs具有一定的抗炎性质，能够抑制氧自由基的产生[27]。氧自由基可调节细胞因子与趋化因子引起的炎性反应，其产生增多则会使炎性反应加重，进而通过线粒体呼吸链反应引起细胞内氧自由基的产生，降低细胞生理生化功能，加速细胞的衰老，而AuNPs的适当应用则会抑制该过程，增加聚糖和胶原的产生。

3 小 结

综上所述，不同直径、不同修饰的AuNPs在骨科学细胞领域有着独特的作用，如促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，刺激成骨细胞与软骨细胞相关生长因子的表达，抑制破骨细胞生长等，降低ROS的产生，具有一定的抗炎作用[28]，同时由于其良好的生物相容性，可以作为药物载体，从而更好发挥药物效能[29]。虽然AuNPs有着独特的生物学作用，但目前仍在问题，比如其适用于人体中并且对细胞有着正性作用（如促进增殖，增强组织细胞合成能力）时的浓度要求；不同直径、不同修饰的AuNPs性质的确定；在靶向运输中，作为稳定的药物载体，如何提高其与目的器官与细胞的靶向结合等，进而更应用于临床治疗，都是目前需要明确与解决的问题。纳米技术作为21世纪的新兴技术，在生物医学领域有着巨大的研究与应用前景，而AuNPs则在众多纳米粒子中扮演着重要的角色。AuNPs更多的生物效能在今后将会被发现，性质将会更加趋于稳定，其在生物医学领域中的应用亦将愈来愈广泛。

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（2017-12-08收稿2017-03-15修回）

（本文编辑 宋宫儒）

Advances in the effect of AuNPs on proliferation and metabolism of orthopedic-related cells

LIN Chen and XING Gengyan. Clinical School of General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Anhui Medical University, Beijing 100039, China
Corresponding author: XING Gengyan, E-mail: xgy7766@263.net

Research on gold nanoparticles (AuNPs) has showed commendable results and application prospects in chemistry, biology and medicine. It also showed promise as a biomaterial for tissue engineering in orthopaedics cells, such as osteablast, osteoclast, chondrocyte and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs) and so on. The AuNPs with different particle sizes and functional groups influence cell viability differently, and simultaneously obtain cell information.

AuNPs; osteocyte; orthopedics

R87

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.04.014

100039 北京，安徽医科大学武警总医院临床学院

邢更彦，E-mail：xgy7766@263.net