一株高耐镉菌株的分离、鉴定及系统发育分析

黄 军，靳 磊，魏小武，罗容珺，程 伟，单世平，郭照辉

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

一株高耐镉菌株的分离、鉴定及系统发育分析

黄 军，靳 磊，魏小武，罗容珺，程 伟，单世平，郭照辉

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

采用梯度浓度驯化方法，从极度重金属污染环境的土壤中取样分离、纯化1株具有较强镉耐受性的菌株（编号为LY29-1-5）。经菌落、菌体形态观察、生理生化及系统发育分析，该菌株初步鉴定为大肠杆菌（Escherichia coli）。该菌株能耐受镉离子的最高浓度为15 mmol/L，在最低抑制浓度试验中，该菌株对铅、铜、锌也表现出了一定的耐受性。

梯度浓度驯化；镉抗性菌株；系统发育分析；大肠杆菌；抑制浓度

微生物是土壤中最活跃的生命因子，可通过多种方式降低土壤重金属的生物有效性和可迁移性，在土壤生态系统中承担着重要的生态功能。鉴于传统镉污染土壤修复方法的不足，利用土壤微生物原位修复重金属污染成为研究的热点。可通过向污染土壤中添加镉吸附性微生物，利用这些微生物的表面活性基团对重金属进行胞外沉淀、络合、胞内积累和氧化还原等作用，降低土壤中重金属镉的活性及农产品中的镉含量[1-9]。试验从严重镉污染土壤中取样，分离纯化了1株具有较强镉抗性的菌株，并通过形态观察、生理生化及系统发育分析，研究了该菌株对镉和其他重金属的耐受性，旨在为探索开发更多高效、实用的土壤原位微生物钝化产品和生物吸附剂产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 耐镉细菌菌株的分离和纯化

在湖南省重金属污染严重的土壤中，采用常规方法采集土壤样品5份，用于镉高固定微生物的分离、筛选。

耐镉细菌菌株按照以下步骤分离和纯化：（1）将10 g土壤加入到装有90 mL无菌水（含吐温-80）的三角瓶中，摇床振荡30 min，静止20 min；（2）用装有4.5 mL无菌水的试管梯度稀释10-5～10-2；（3）按2 mmol/L终浓度将镉溶液加入LB培养基中，制备平板；（4）平板冷却后，每个梯度取200 μL土壤浸出液涂布于平板上，重复3次；（5）待平板将液体完全吸收后，30℃恒温培养；（6）培养2～3 d后，挑取形态差异大、生长良好的菌落在含镉平板上划线纯化，将挑取划线培养的单菌落移入试管斜面保存备用。

1.2 耐镉细菌镉抗性驯化筛选

将细菌菌株活化，用接种环分区划线于含2 mmol/L镉的LB平板上，28～30℃恒温箱中培养3～5 d后，将生长良好的细菌转接到4 mmol/L镉的LB平板上，在后续培养中，依次递增镉平板浓度，重复上述实验。

1.3 菌株LY29-1-5的菌落、菌体形态观察

在固体培养基上观察LY29-1-5的菌落形态，在光学显微镜下进行菌体形态观察。

1.4 菌株LY29-1-5的生理生化分析

葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等糖醇类的氧化发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验及硫化氢试验的具体方法均参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）和文献[10]。

1.5 菌株LY29-1-5的鉴定

1.5.1形态鉴定将纯化的细菌划线接种于LB培养基上，30℃培养72 h，观察菌落形态、大小、颜色、表面及边缘等特征。

1.5.2分子鉴定提取DNA后，对16S rDNA目的片断进行PCR扩增[11]。引物序列：F，5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'；R，5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'。PCR反应体系（50 μL）：去离子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各l μL，基因组DNA 1 μL，DNA聚合酶1 μL。PCR反应条件：94℃预变性4 min；94℃变性50 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，29个循环。72℃终末延伸10 min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。使用MEGA5.2软件构建系统发育树。

1.6 菌株对多种重金属的抗性试验

菌株活化后分别加入相应浓度（15、10、8、6、0.1和0.09 mmol/L）的6种重金属（Cd2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+）溶液（分别由CdCl2、Zn(NO3)2、Pb(NO3)2、CuCl2、HgCl2和AgNO3配制），约24 h后取出，用比色法测定各重金属菌液的OD600值。

2 结果与分析

2.1 耐镉菌株的梯度分离和驯化结果

用含2 mmol/L镉细菌培养基平板，分离到了150个细菌菌株，经过驯化筛选到的LY29-1-5菌株，在15 mmol/L的镉平板上能生长（图1）。

图1 菌株LY29-1-5的菌落形态

2.2 细菌LY29-1-5的革兰氏染色、形态观察及生理生化试验结果

2.2.1形态特征菌株LY29-1-5在LB培养基上28℃下培养48 h后，菌落形态规则，湿润，不透明，粉红色。菌体杆状，最适生长温度26～30℃，革兰氏染色为阴性。

2.2.2生理生化特性生理生化实验结果：吲哚实验和甲基红实验为阳性；V-P实验、柠檬酸盐实验、产硫化氢实验为阴性；可利用葡萄糖、麦芽糖和甘露醇等碳源。

2.3 细菌LY29-1-5的16S rDNA序列分析

由图2可知，可测定LY29-1-5菌株的16S rDNA序列全长为1 452 bp。将经测序得到的序列进行Blast序列分析，LY29-1-5与大肠杆菌（Escherichia coli strain H1）的16S rDNA序列同源性达96%。

图2 细菌LY29-1-5的16S rDNA PCR结果

2.4 细菌LY29-1-5的系统发育分析

随机选取同源性较高的11株细菌的16S rDNA序列，与菌株LY29-1-5的16S rDNA序列进行系统发育分析，并构建系统发育树。由图3可知，菌株LY29-1-5与大肠杆菌（Escherichia coli strain H1）具有较近的同源性。基于该菌株的菌体和菌落形态、生理生化分析，该菌株初步鉴定为大肠杆菌。

图3 细菌LY29-1-5的16S rDNA序列系统发育树

2.5 菌株LY29-1-5的多金属抗性分析

多金属抗性分析结果表明，该菌株对Hg2+和Ag+比较敏感，微量的Hg2+和Ag+存在时，该菌株的生长基本受到抑制；该菌株对Cd2+和Zn2+抗性较强，对Pb2+和Cu2+次之（图4）。因此该菌株具有抗多种重金属的能力，这为菌株在复杂的土壤环境中的生存和繁殖提供条件。

图4 细菌LY29-1-5对6种重金属的最低抑菌浓度

3 结论与讨论

研究从湖南省极度重金属污染的土壤中利用高通量筛选技术分离、纯化到1株重金属镉高耐性菌株LY29-1-5，该菌株经菌体、菌落形态观察、分子生物学鉴定及系统发育分析，初步确定为大肠杆菌。经多种重金属的抗性分析发现，该菌株对多种重金属特别是土壤污染中常见重金属Cd2+、Zn2+、Pb2+等均表现出不同程度的抗性水平。

近年来，随着重金属对土壤环境的污染加剧，其治理技术措施也面临巨大的挑战。在具体的实施过程中，不同的方法具有不同的优缺点。微生物体积小、比表面积大、繁殖速度快、代谢旺盛、种类多、容易培养、对环境有很强的适应性，是人类最宝贵的资源库。随着污染物的不断累积，微生物的种类和代谢类型呈现出多样性，微生物的形态结构和生理遗传优势使它们在污染物的降解转化、生态环境保护等方面具有巨大的潜力。因此，研究微生物资源的开发利用，探索开发更多高效、实用的土壤原位微生物钝化产品和生物吸附剂产品用于去除重金属具有重要的经济和社会意义。

[1] 王慧萍. 耐锌细菌的筛选、抗锌特性及其对苯酚的降解研究[D].上海：东华大学，2011.

[2] Cooksey C. Health concerns of heavy metals and metalloids[J]. Sci Prog，2012，95（Pt 1）：73-88.

[3] 夏利亚，来俊卿. 土壤重金属污染及防治对策[J]. 能源环境保护，2011，25（4）：54-55，58.

[4] Sun B，Zhang L，Yang L，et al. Agricultural non-point source pollution in China: causes and mitigation measures[J]. Ambio，2012，41（4）：370-379.

[7] Su C C，Long F，Yu E W. The Cus efflux system removes toxic ions via a methionine shuttle[J]. Protein Sci，2011，20（1）：6-18.

[8] Dhankhar R，Hooda A. Fungal biosorption--an alternative to meet the challenges of heavy metal pollution in aqueous solutions[J]. Environ Technol，2011，32（5-6）：467-491.

[9] 张甲耀，宋碧玉，陈兰洲，等. 环境微生物学[M]. 湖北：武汉大学出版社，2008.

[10] 东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001.

[11] 奥斯伯. 精编分子生物学实验指南（第五版）[M]. 北京：科学出版社，2008.

（责任编辑：夏亚男）

Isolation, Identification and Phylogenetic Analysis of a High Cd-resistance Bacterial Strain

HUANG Jun，JIN Lei，WEI Xiao-wu，LUO Rong-jun，CHENG Wei，SHAN Shi-ping，GUO Zhao-hui
（Hunan Academy of Microbiology, Changsha 410009, PRC）

A high Cd-resistance strain (No. LY29-1-5) was isolated and purified from extremely heavy metal contaminated soil by acclimation of concentration gradient approach. The strain was identifed as Escherichia coli by morphological examination, physiological and biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis. The strain could endure 15 mmol/L maximum concentration of cadmium (Cd2+). The strain was also proved to have the ability to resist Pb2+, Cu2+, Zn2+through experiment of minimum inhibitory concentration (MIC).

acclimation of concentration gradient; Cd2+resistance strain; phylogenetic analysis; Escherichia coli; inhibitory concentration

book=15,ebook=23

X53

A

1006-060X（2016）12-0015-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.012.005

2016-09-01

湖南省自然科学基金项目（13JJ2035）；农业部、财政部“长株潭”耕地重金属污染修复及农作物种植结构调整子项目（农办财函[2016]6号）

黄 军（1977-），女，湖南岳阳市人，助理研究员，主要从事农业微生物和农田重金属污染修复治理等方面的研究。

郭照辉