肝细胞癌中CK7、CK19及AFP的表达相关性研究

郑智爽 高亚博 吴 侃 景赛赛 朱 珏 许 远 钟亚珍 陈素梅 余殊寰 石 蕾 吴稚冰

肝细胞癌中CK7、CK19及AFP的表达相关性研究

郑智爽 高亚博 吴 侃 景赛赛 朱 珏 许 远 钟亚珍 陈素梅 余殊寰 石 蕾 吴稚冰

目的探讨CK7、CK19在肝细胞癌（HCC）中的表达，以及与HCC患者甲胎蛋白（AFP）表达及临床病理特征的关系。方法收集65例原发性HCC患者的癌组织标本及血清标本，免疫组化检测CK7、CK19表达情况，并用ELISA法检测血清中AFP水平。结果HCC患者癌组织中CK7的表达阳性率为46.2％（30/65），CK19表达阳性率为18.5％（12/65）。HCC癌组织中可见表达CK7、CK19的卵圆细胞，可同时表达AFP。CK19表达与血清AFP表达水平有显著相关性（P=0.000）。结论人类HCC中同样有卵圆细胞的存在，这部分HCC患者预后较差，AFP及CK19的联合检测可有助于这部分患者的早期诊断。

肝细胞癌AFP卵圆细胞CK19

人肝细胞癌（HCC）中存在少数卵圆细胞，它们既表达甲胎蛋白（AFP）和肝细胞抗原（HEP），又表达胆管标记CK7和CK19，具有双向分化的潜能，是一类肝前体细胞或干细胞样细胞[1]。动物实验证实，卵圆细胞可以发生HCC、胆管上皮癌和未分化癌，说明卵圆细胞作为肝前体细胞，参与了肝肿瘤的形成[2-3]。已有研究表明，CK7、CK19阳性的HCC可能来源于卵圆细胞，这部分患者预后较差[4-5]。现已证实肝炎病毒与HCC的发生密切相关，乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是HCC发生的主要病因[6]，在人类病毒性肝炎、肝硬化的组织演变过程中均可检测到类似动物的卵圆细胞，后者参与了疾病的发生、发展[7-8]。本研究探讨了CK7、CK19在HCC中的表达，以及与患者临床病理特征的关系，以期对HCC患者的预后评估及治疗提供帮助。

1 材料和方法

1.1 材料收集杭州市第一人民医院2008至2013年的HCC患者手术切除癌组织标本65例，均经临床和影像学检查证实，并根据病理组织学最终确诊。其中男56例，女9例，年龄42～75岁，平均63岁。分期均为Ⅰ～Ⅱ期。所有标本组织均经10％甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，分别行HE和免疫组化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测免疫组化采用En Vision二步法，65例HCC系列切片，常规脱腊复水，3％H2O2室温孵育10min，微波抗原修复，分别滴加CK7（1∶100，丹麦Dako公司产品），CK19（1∶100，丹麦Dako公司产品），Hepar1（1∶50，丹麦Dako公司产品），4℃过夜后，二抗室温孵育1h，DAB显色，苏木素衬染。CK7和CK19均为肿瘤细胞胞质染色，呈淡黄色至棕褐色为阳性。400倍光镜下计数5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的比例，阳性细胞＞5％判定为阳性，半定量以5％～50％为+，＞50％为++。

1.2.2 血清学检测所有患者AFP及HBV水平均采用ELISA法检测，AFP均为术前检测，正常参考值AFP＜20ng/ml，以AFP≥20ng/m l为阳性。

1.3 统计学处理采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 HCC患者癌组织中CK7及CK19的表达情况HCC癌组织中CK7的表达阳性率为46.2％（30/65），CK19表达阳性率为18.4％（12/65），见表1。CK7和（或）CK19阳性的细胞大多体积较小，形态较一致，核圆形或卵圆形，胞质稀少，细胞核质比高。还有一些细胞处于中间过渡形态，与CK7阴性的肿瘤细胞有明显区别。这些形态学特征与过去报道的肝前体细胞和移行细胞或中间表型（肝-胆管样细胞）一致[1-4]，见图1a细箭头所示。

表1 65例HCC患者癌组织中CK7及CK19的表达情况[例（％）]

2.2 HCC癌组织中卵圆细胞形态学观察HCC癌组织周围非肿瘤组织纤维间隔内可见大量增生的胆小管，这些胆小管均可表达CK7及CK19，其中可见CK19阳性、核卵圆、胞质稀少的卵圆细胞，见图1a中粗箭头所示，这些细胞可同时表达AFP，见图1b。

图1 HCC患者癌组织中CK19的表达[a：癌旁纤维间隔内可见CK19阳性表达的卵圆细胞（细箭头所示），同时可见CK19阳性，胞质稀少的卵圆细胞（粗箭头所示）；b：同时表达AFP的卵圆细胞（粗箭头所示）；En Vision二步法染色，×100]

2.3 血清AFP水平与CK7、CK19表达的关系在既往研究基础上，依据AFP水平将标本分为AFP显著升高组（＞1 000ng/ml）和AFP未显著升高组（＜1 000ng/m l，含正常组）。AFP显著升高组AFP水平（1 156.8～23 918.0）ng/ml，平均（7 447.1±1 450）ng/ml。AFP未显著升高组AFP水平（3.7～851.0）ng/ml，平均（157.4±200.0）ng/ml。两组间比较，CK7表达阳性率无统计学差异（P＞0.05），而CK19表达和肿瘤大小却均有统计学差异（均P＜0.05）。两组间性别比例、平均年龄以及血清HBsAg表达阳性率均无统计学差异（均P＞0.05），见表2。

表2 血清AFP水平与患者临床病理特征的关系

3 讨论

动物实验证实卵圆细胞能够在肝脏严重损伤、肝细胞增殖受抑制的情况下被活化，参与HCC的发生。卵圆细胞可表达CK7和CK19，而在人类多种肝脏疾病中也发现类似的卵圆细胞，具有相似的形态学特点，同样可表达CK7和CK19[7-8]。本研究表明CK7、CK19均可在部分HCC中表达，CK7表达阳性率为46.2％，CK19的表达阳性率为18.5％，与文献报道一致[4-5]。表达CK7和（或）CK19的肿瘤细胞大多体积较小，形态较一致，核圆形或卵圆形，胞质稀少，细胞核质比例高，与动物实验中的卵圆细胞形态相似，提示此类表达CK7和（或）CK19的HCC可能来源于卵圆细胞的异常分化。笔者前期研究的ROC发现，AFP水平为1 000ng/ml的时候CK19表达阳性率在研究组和对照组之间具有统计学差异，AUC也较AFP其它取值大，而CK7则尚无合适的AFP阈值能够将研究组和对照组进行有效区分，因此本研究中将1 000ng/ml设定为AFP阈值。

大鼠致癌诱导模型的早期阶段，血清AFP的升高同时伴随卵圆细胞的出现，卵圆细胞可表达AFP，证实卵圆细胞可能与AFP的产生密切相关[3,9]。同样AFP的持续升高是HCC患者诊断的一个重要指标，病毒感染是HCC的一个重要致病因素，人HBV以及HCV相关肝硬化的组织中均有类似的卵圆细胞存在，而且人类肝组织中的卵圆细胞也可表达AFP[7-8，10]，提示部分HCC患者AFP的异常升高可能也来源于卵圆细胞。本研究发现AFP显著升高组CK19表达阳性率明显高于AFP未显著升高组，具有统计学差异，表明HCC患者中AFP水平除了与肿瘤体积大小有关外，与肝脏前体细胞的激活也有一定关系，而尽管两组间HBsAg阳性率无统计学差异，但却均有很高的HBV感染率，表明HBV仍是HCC的主要病因，并可损伤肝细胞，诱导卵圆细胞的激活增殖，从而参与HCC的发生、发展。

肝前体细胞有不同的分化阶段，CK19和（或）CK7阳性表达的HCC可能具有不同的前体细胞来源。本研究中发现HCC癌旁组织增生的胆小管中可见CK19及AFP同时阳性表达的卵圆细胞，CK7的表达阳性率在AFP水平不同的组间并无统计学差异，而CK19的表达阳性率有统计学差异，证明CK19可能是一个相对更加特异的卵圆细胞标记。已有研究表明CK19阳性的患者术后易复发，淋巴结转移以及血管侵袭较常见，预后较差[5]，提示这类HCC可能来源于卵圆细胞的恶性转化，因此CK19联合AFP检测对于提示卵圆细胞的存在可能更有临床价值。

以上研究再次证实了人类HCC中同样有卵圆细胞的存在，CK7和（或）CK19及AFP阳性的HCC可能来源于卵圆细胞的恶性转化，而CK19阳性的卵圆细胞可能是分化更早期的肝前体细胞，活化可以伴随AFP的高表达，因此AFP及CK19的联合检测有助于HCC患者的早期诊断，并有利于改善患者预后。

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ObjectiveTo investigate the exp ression of CK7 and CK19 in hepatocellular carcinoma(HCC)and its relation to c linicopathologic features.MethodsSerum and tissue sam p les were collected from 65 patients w ith HCC.The exp ression of CK7 and CK19 in HCC tissue was detected w ith immunohistochem istry,the serum AFP levels weremeasured w ith enzyme-linked immunoassay(ELISA)method.ResultsThe positive exp ression rates of CK7 and CK19 in HCC tissue were 46.2％(30/65)and 18.5％(12/65),respectively.Oval cells were detected in HCC which exp ressed CK7,CK19 and AFP.The exp ression of CK19 in HCC was significantly correlated w ith serum AFP levels(P=0.000).ConclusionThe bipotenthepatic p rogenitor cells(HPCs)in HCC exp ress CK19 and AFP,ind icating that combined detec tion of tissue CK19 exp ression and serum AFP levelmay be help ful in early d iagnosis ofhepatocellular carcinoma w ith HPCs.

HCC AFP Ovalcells CK19

2015-06-25）

（本文编辑：胥昀）

310002杭州市肿瘤医院放疗科

吴稚冰，E-mail：wu_zhibing@163.com