肾穿六胺银套染马松三色双重染色的改进

肾穿六胺银套染马松三色双重染色的改进

叶美华 方庆全 张海芳

目的 探讨改进肾穿六胺银套染马松三色的染液与染色方法的可行性。方法 收集2015年1月—2016年12月厦门大学附属第一医院病理科已确诊的100例肾穿刺活检病例的蜡块，每例蜡块连续切片2片，随机分为两组。甲组采用传统染液与传统染色法染色，乙组采用改进染液与改进染色法染色，以百分制评定200张六胺银套染马松三色染色片的得分，统计各组的得分，结果用（）表示，采用独立样本t检验进行比较，分析两组得分的差异是否有统计学意义，并比较两组显微镜下的染色结果。结果 乙组染色的得分高于甲组[（88．7±9．6）分vs．（72．2±10．3）分]，差异有统计学意义（t＝11．719，P＜0．001）；乙组切片镜下显示肾小球鲍曼囊和毛细血管襻基膜均呈黑色细丝状，细胞核呈紫蓝色，网状纤维和弹力纤维呈黑色，免疫复合物、细胞质与红细胞均呈红色，细胞间质与胶原纤维呈绿色，组织结构清晰，着色均匀，优于甲组。结论 改进染液与染色方法使六胺银套染马松三色的染色效果好。

肾穿；六胺银套染马松三色 ；改进

目前，肾脏疾病最可靠的一种诊断方式是穿刺活组织病理检查，该检查对肾脏疾病的发病机制、病变类型以及病程进展等方面的了解提供了可靠的依据，对治疗方案的选择与判断预后具有重要意义[1]。肾穿刺活检组织病理诊断中，光镜检查包括苏木素-伊红染色（HE）、高碘酸-雪夫氏染色（PAS）、六胺银染色（PASM）及马松三色染色（Masson）[2]，其中PASM染色法是重要的检查方法，能清晰的显示基底膜增厚“叮突”和“双轨”等病理变化，又可以显示肾小球毛细血管或球囊壁基底膜在炎性损伤中的形态学改变[3]。但是，传统的PASM染色是用HE染色复染的，对观察肾小球中的免疫复合物的形态和定位不利，六胺银套染马松（PASMMasson）三色染色则能在同一切片上观察肾小球基底膜的改变，同时又可观察免疫复合物的沉积，所以肾穿刺活检病理组织切片染色中，PASM-Masson染色是最为重要的染色之一[4]。但在实际操作过程中，传统的PASM-Masson染色效果不理想，不能很好地显示免疫复合物沉积情况，基底膜显色比较重，背景深，染色时间太长，而且组织表面常有杂质粘附，常常影响病理诊断结果。由此，笔者对染液的配制和染色方法等方面进行了改进，取得很好的效果。

1 资料与方法

1.1 资料

收集2015年1月—2016年12月厦门大学附属第一医院病理科已确诊的100例肾穿刺活检病例的蜡块，每例蜡块连续切片2片，切片厚1～2 μm，随机分为两组。

1.2 方法

1.2.1 传统试剂配制 （1）0.5%高碘酸100 ml。（2）8%铬酸100 ml。（3）1%偏重亚硫酸钠。（4）5%硝酸银溶液。（5）3%六次甲基四胺水溶液。（6）5%四硼酸钠。（7）六胺银工作液：取0.5 ml的5%硝酸银溶液缓缓加入到10 ml的3%六次甲基四胺溶液中，立即形成乳白色沉淀，摇动沉淀即可溶解变清。再加入2 ml的5%四硼酸钠溶液，混匀，加入25 ml的蒸馏水，混匀后即可使用。（8）丽春红酸性复红染液：丽春红0.7 g，酸性品红0.3 g，蒸馏水99 ml，冰醋酸1 ml。（9）1%亮绿溶液100 ml：亮绿1 g，蒸馏水99 ml，冰醋酸1 ml。（10）2%苯胺蓝染液100 ml：苯胺蓝2 g，蒸馏水98 ml，冰醋酸2 ml[5-6]。

1.2.2 改进试剂配制 （1）1%高碘酸100 ml。（2）5%铬酸100 ml。（3）2.5%草酸100 ml。（4）六次甲基四胺储备液：5%四硼酸钠溶液50 ml，3%六次甲基四胺溶液50 ml，5%硝酸银溶液50 ml。（5）六胺银工作液：取2 ml的5%硝酸银溶液，加入18 ml的六次甲基四胺储备液中，该溶液即变为乳白色悬浊液，再加入2 ml的四硼酸钠溶液，此时该溶液变成澄清透明；最后加入蒸馏水22 ml。（6）1%酸性品红溶液：酸性品红1 g，蒸馏水99 ml，冰醋酸1 ml。（7）1%丽春红溶液：丽春红1 g，蒸馏水99 ml，冰醋酸1 ml。（8）复红液工作液：1%酸性品红：1%丽春红按2∶1的比例混合后使用。（9）0.5%亮绿溶液100 ml：亮绿0.5 g，蒸馏水99 ml，冰醋酸1 ml。

1.2.3 传统染色方法 参照中华医学会编制的《临床技术操作规范病理学分册》的操作方法[5]。

1.2.4 改进染色方法 （1）切片厚1～2 μm；（2）常规脱蜡至水；（3）1% 高碘酸溶液处理10 min，蒸馏水洗1 min×2；（4）5%铬酸溶液处理40 min，蒸馏水洗1 min×2；（5）2.5%草酸溶液1 min，蒸馏水洗1 min×2；（6）切片放入预热至60℃新鲜配制的六胺银工作液中20～35 min；蒸馏水速洗数次，用纸巾擦掉周围的杂质；（7）0.2%氯化金调色（显微镜下观察肾小球基底膜着色情况）；蒸馏水洗1 min；（8）2%硫代硫酸钠处理1 min（显微镜下观察背景强弱），蒸馏水洗1 min；（9）再用0.2%氯化金速洗，流水冲洗约5 min；（10）1%天青石蓝媒染3 min，水洗；（11）Harris苏木精复染5 min，水洗，分化，弱碱性溶液或温水返蓝3 min，蒸馏水洗；（12）切片于复红工作液中15 min，水洗；（13）1%磷钼酸溶液处理5 min，不用水洗，改用0.5%冰醋酸洗1 min；（14）0.5%亮绿30 s，0.5%冰醋酸洗1 min；（15） 高浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.5 染色 甲组：采用传统试剂及传统染色法染色；乙组：采用改进试剂及改进染色法染色。

1.2.6 评片 切片由2名主治医师进行双盲评片，采用百分制评分。

1.3 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行分析，计量资料采用t检验，结果用（）表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 评分的比较

乙组染色得分高于甲组染色得分[（88.7±9.6）分vs.（72.2± 10.3）分]，差异有统计学意义（t＝11.719，P＜0.001）。

2.2 染色效果比较

甲组：肾小球基底膜与肾小管基膜呈黑色，显色比较重，常伴有银颗粒沉淀，细胞核呈蓝色，免疫复合物呈红色，细胞质与红细胞呈红色，但杂质较多，细胞间质与胶原纤维部分呈绿色，部分不着色，着色不均匀，背景欠清晰。乙组：肾小球鲍曼囊和毛细血管襻基膜均呈黑色细丝状，细胞核呈紫蓝色，网状纤维和弹力纤维呈黑色，免疫复合物、细胞质与红细胞均呈红色，细胞间质与胶原纤维呈绿色，组织结构清晰，着色均匀。

3 讨论

肾穿刺活检是临床进行肾病诊断最有效的措施，对于肾脏疾病的治疗及预后的改善均具有重要意义[7]。在肾活检中，六胺银染色的基本原理是肾小球基底膜和系膜区等部位的蛋白多糖经1%过碘酸氧化后醛基暴露，暴露的醛基再与六氨银染液中银离子发生银镜反应[8]，染色结果：肾小球基膜、肾小管基膜呈黑色，细胞核呈蓝色[9]。而PASM加Masson套染实验中，肾小管基膜、肾小球、细胞膜基质呈黑色，胶原纤维绿色，细胞核呈蓝色，免疫复合物呈红色。这显示PASM-Masson三色双重染色方法能更清晰显示免疫复合物、基膜、胶原纤维[10]。

作者经过多次实验对比发现：（1）由于肾小球基底膜富含黏多糖，需要经过氧化才能使醛基暴露，肾小球基底膜上暴露的醛基吸附银沉淀使肾小球基膜呈黑色，氧化是肾小球基底膜染色的前提。通常采用高碘酸和铬酸进行双重氧化，其中高碘酸的作用比较温和，作者将其使用浓度由传统的0.5%提高至1%，加强氧化作用，在实验过程中未发生脱片现象。但铬酸为强氧化剂，且具有较强的腐蚀性，浓度过高易导致组织脱片，作者将其使用浓度由传统的8%降至5%，有效地防止组织脱片。实践证明，用1%高碘酸和5%铬酸双重氧化后肾小球基膜着色深，染色效果好。（2）在中断六胺银浸染步骤中，传统方法用蒸馏水洗后即进行镜下检查。作者实践发现，蒸馏水冲洗后，务必用纸巾擦掉组织周围玻片上的银杂质，否则冲洗时杂质会附着在组织上，背景不清晰，有银颗粒沉积。（3）在切片染色中，由于肾小管基底膜比肾小球基底膜着色更早，在显微镜下观察基底膜浸染是否适度时，应以肾小球基底膜着色强度为标准，即肾小球基底膜着色至黑色，而背景呈黄棕色为准[11]。（4）改进方法中，2次氯化金调色非常关键。如果氯化金调色不足，棕黄或棕红色成分将会遗留在肾小球和增生的新月体内，将会影响对免疫复合物沉积部位、肾小球囊壁基底膜等结构的分析。使用硫代硫酸钠溶液处理后，肾小管管壁呈浅灰至深灰色不等，基底膜呈深灰色，管腔基本不着色。再用氯化金速洗一次可以调整肾小球基底膜的细丝状线条由灰黑色变深呈黑色，基底膜的细丝状线条变得更加柔和，更有利于肾小球疾病在显微镜下的观察。（5）改进方法中，天青石蓝与苏木精联合应用可以增强对核的染色作用。（6）马松套染时，改进方法将1%酸性品红与1%丽春红溶液分别配制后存放，临用前按1%酸性品红：1%丽春红按2∶1的比例混合后使用，染色效果比传统方法更佳。（7）本实验所用的实验玻璃器皿均应用本科室自配的清洁液浸泡，然后彻底冲洗干净，再用蒸馏水反复冲洗后才能使用。整个实验过程中，应避免银试剂与金属物品接触，因为银溶液会与多种金属物品发生置换反应，导致染液的染色力下降甚至消失。

综上所述，改进的染液和改进的染色方法能使六胺银套染马松三色的染色效果佳。

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Modified Double Stain of PASM and Masson Trichrom for Renal Needle Biopsy

YE Meihua FANG Qingquan ZHANG Haifang Pathology Department, The First Aff i liated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003, China

Objective To explore the effect of modified double stain of PASM and Masson trichrom for renal needle biopsy dyeing dye solution preparation. Methods To collecte 100 cases of renal biopsy diagnosis of wax in the fi rst aff i liated hospital of xiamen university from January 2015 to December 2016, each wax of 100 cases was cut into two serial sections and divided into two groups randomly. Group A division was dyed by traditional dye solution under the traditional dyeing method. Group B division was dyed with modified method. Evaluation of 200 six silver amine or Masson staining score sheet. The scores of each group were presented in the form of（）. To with the independent sample t-test, and analyze the statistical significance, and the staining results of were compared between the two groups under the microscope. Results The results of group B staining score higher than that of group A [(88.7±9.6)vs. (72.2±10.3)], the difference was statistically signif i cant (t= 11.719,P＜ 0.001). Under the microscope, the result of group B slices showed that bauman capsule and glomerular capillaryloop in basement membrane were black fi laments, purple and blue nuclei, reticular fi bers and elastic fi bers were black, the immune complexes, cytoplasm and red blood cells were red, the intercellular and collagen fibers were green, clear boundaries and uniform coloring, better than group A. Conclusion The modif i ed double stain of PASM and Masson trichrom dye solution preparation method and improved dyeing method is significantly better than the traditional method.

renal needle biopsy; double stain of PASM and masson trichrom; modif i ed

R361

A

1674-9316（2017）07-0126-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．07．077

厦门大学附属第一医院病理科，福建 厦门 361003

方庆全