鼠曲草类黄酮及其锌络合物的抑菌活性

林华婷，吕 峰，黄国钞

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

鼠曲草类黄酮及其锌络合物的抑菌活性

林华婷，吕 峰，黄国钞

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

采用滤纸片法和稀释法，测定、比较了鼠曲草类黄酮(GDF)及其锌络合物(GDF-Zn)对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性和最低抑菌浓度(MIC)，并进一步研究抑菌时间对GDF和GDF-Zn抑菌作用的影响.结果表明，GDF和GDF-Zn对上述4种菌均有明显的抑制效果，且GDF-Zn的抑菌效果更好，随着样液与菌悬液作用时间增长至8～10 h，抑菌率均增至最大值，此外，二者对所试菌株中的革兰氏阳性菌的抑菌活性均强于革兰氏阴性菌；GDF和GDF-Zn对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的MIC分别为0.20、0.40、0.20、0.10 mg·mL－1和0.20、0.20、0.20、0.10 mg·mL－1.

鼠曲草类黄酮；类黄酮锌络合物；抑菌活性

微生物污染不仅会引起食品腐败变质，造成直接经济损失，而且会引发食品中毒，威胁人类生命安全，防腐剂的使用是抑制微生物生长，有效防止食品腐败变质的一种简单有效的方法，但人工合成的防腐剂因对人体存在潜在危害而引起了人们的关注，因此从植物中寻找高效、低毒的天然抑菌剂具有重要的实际意义[1].

类黄酮是植物界中分布十分广泛的一类重要的生物活性物质，研究表明，类黄酮及其金属络合物具有很强的抑菌活性[2－3].类黄酮是鼠曲草中主要的生物活性成分，鼠曲草类黄酮(Gnaphlium affine flavonoids，GDF)为鼠曲草抗炎抑菌和抗氧化等功效发挥重要作用.近几年，随着绿色食品和医疗保健的兴起，类黄酮以其纯天然、活性高、见效快而作为一类极具潜在开发价值的天然防腐剂资源引起人们的日益关注[4].类黄酮金属络合物是利用金属离子与类黄酮在一定条件下螯合而成的稳定络合物[5]，将类黄酮与人体必需金属元素络合形成类黄酮金属络合物，并发挥其抑菌活性的协同增效作用是较新的研究领域[6－9]，目前国内在该方面的研究还很匮乏.

本试验采用滤纸片法和稀释法测定了GDF及其锌络合物(GDF-Zn)对金黄色葡萄球菌(Staphylococ-cus aureus)、沙门氏菌(Salmonella lignieres)、大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)4种常见致病菌的抑菌活性和最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations，MIC)，分析比较二者对致病菌的抑制作用，评价其生物活性，为深入开展GDF及其金属络合物的功能性研究提供参考，并为类黄酮新型防腐剂的寻找和开发提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

鼠曲草的鲜草采自福建屏南地区.将采摘的全草清洗干净，沥水，置于50℃恒温干燥箱中干燥12 h，粉碎过80目筛.

供试菌种为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，均由福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供.

无水乙醇、乙酸锌、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸钠、柠檬酸、山梨酸钾和氯化钠均为食品级；蛋白胨、琼脂和牛肉膏均为生化级.

主要仪器设备有79-1型磁力搅拌器(上海怡临仪器科技有限公司)、UV-1800PC紫外可见分光光度计(美谱达仪器)、DL-5-B型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)、HWS26型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、LS-B型杀菌锅(上海医用核子仪器厂)、DHP-9162型恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)、HD-650-U标准型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)和ZHWY-103B多振幅轨道摇床(上海智城分析仪器制造).

1.2 方法

1.2.1 GDF和GDF-Zn的制备 采用超声辅助提取工艺制备GDF粗提物.以无水乙醇为溶剂配制初始含量为1.5 mg·mL－1的GDF粗提液，调节其样液pH为8.0，并与9 mg·mL－1乙酸锌络合反应10 min，清洗，过滤，收集沉淀，冷冻干燥，制得GDF-Zn.GDF-Zn用1.5%乙二胺四乙酸解离，减压浓缩，冷冻干燥得纯度为67.47%的GDF.

1.2.2 菌悬液的制备 供试菌株活化后，在无菌室内用接种环从斜面培养基上取3～4环活化的菌种，放入50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃摇床振荡培养24 h，此为试验所用原菌液.用灭菌过的移液枪吸取1.0 mL原菌液加入到9.0 mL无菌生理盐水中，混匀，稀释菌悬液，用平板菌落计数法[10]，控制菌悬液的菌落数均为106～108cfu·mL－1[11]，置于冰箱(2～4℃)中保存备用.

1.2.3 GDF和GDF-Zn抑菌活性的定性测定 为了初步考察待测样品的抑菌效果，先采用滤纸片法进行定性测定[12].分别配制5 mg·mL－1的GDF和GDF-Zn进行抑菌活性的比较，并以0.05 mg·mL－1山梨酸钾为阳性对照，无菌生理盐水为空白对照.用打孔器将新华1号滤纸打成若干直径为6.0 mm的圆纸片，高压灭菌(121℃、30 min)，将灭菌后的滤纸片分别浸于无菌生理盐水、GDF、GDF-Zn和山梨酸钾中12 h.灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中，每皿15～20 mL，冷却凝固制成牛肉膏蛋白胨固体培养基.吸取0.2 mL各种菌悬液至牛肉膏蛋白胨固体培养基中，用无菌涂布棒涂布均匀，然后将浸过并晾干的滤纸片用无菌镊子夹取并贴于含菌平板上，根据培养皿的大小，将其等分成4个部分，分别贴浸过待测GDF、GDF-Zn样液，无菌生理盐水，山梨酸钾的滤纸片，将贴好滤纸片的平板置于(36±1)℃的恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，试验重复3次.

1.2.4 GDF和GDF-Zn MIC的测定 将牛肉膏蛋白胨培养基高压灭菌(121℃、30 min)，并冷却至55℃左右，无菌条件下，准确移取一定体积的两种待测样液加入培养基中，配制成含待测样液含量分别为0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg·mL－1的固体培养基，待冷却凝固后，每皿加入0.1 mL供试菌液，涂匀，置于(36 ±1)℃的恒温培养箱中培养24 h，试验重复3次，观察菌种的生长情况，以不含待测液的培养基作对照，测定MIC[13].

1.2.5 抑菌时间对GDF和GDF-Zn抑菌率的影响 参考刘平等[14]的方法，并作修改.无菌条件下，准确吸取0.2 mL 4种菌悬液分别与1.0 mL含量为0.10 mg·mL－1的两种待测样液充分混匀，分别作用2、4、6、8、10和12 h后，从中移取0.2 mL到已凝固的牛肉膏蛋白胨培养基中，用无菌涂布棒涂布均匀，置于(36±1)℃的恒温培养箱中培养24 h，计算菌落数，以无菌生理盐水代替样液作空白对照，计算抑菌率.试验重复3次.抑菌率/%＝(对照皿菌落数－试验皿菌落数)/对照皿菌落数×100.

1.2.6 数据分析 试验数据以平均值±标准差表示；采用DPS v7.05软件对数据进行统计学分析，显著性界值以P＞0.05为不显著，P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著；釆用Microsoft Excel 2007软件作图.

2 结果与分析

2.1 GDF和GDF-Zn的抑菌活性

抑菌圈的大小可作评价药物抑菌活性指标，抑菌圈的直径越大说明其抑菌效果越佳[15].由图1可以看出5 mg·mL－1的GDF和GDF-Zn对4种供试菌均有明显的抑制作用，抑菌效果均强于山梨酸钾，且GDF-Zn具有更强的抑菌活性.表1显示:GDF和GDF-Zn对枯草芽孢杆菌的抑制作用均最强，抑菌圈直径分别为(22.2±0.1)和(24.5±0.8)mm；对沙门氏菌的抑制作用均最弱，抑菌圈直径分别为(17.8±0.3)和(18.1.5±0.7)mm；而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果居中.研究报道，类黄酮及其金属络合物的抑菌作用与损伤细菌细胞膜以及氧化分裂细菌DNA有关；类黄酮金属络合物比其配体的抑菌作用强，可能是因为形成络合物后共轭效应增强，脂溶性增大，使其与细菌中的DNA、蛋白质结合能力增强，从而达到更好的抑菌效果[16]；此外，GDF-Zn的抑菌作用增强还可能是因为Zn2＋本身也具有抑菌活性[17]，Zn2＋与GDF协同增效，使其抑菌活性更高.

表1 GDF和GDF-Zn的抑菌效果1)Table 1 Antimicrobial activities of GDF and GDF-Zn

2.2 GDF和GDF-Zn对4种菌的MIC

MIC是衡量抗菌药物抑菌活性的一个客观指标，是指在体外培养细菌18～24 h后能完全抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度[18].配制不同含量的GDF和GDF-Zn进行MIC试验，结果如表2所示.

从表2可以看出:与“2.1”的结果一致，GDF和GDF-Zn对枯草芽孢杆菌的敏感度最高，二者对其的MIC均为0.1 mg·mL－1；此外，GDF-Zn对其他3种菌的MIC均为0.2 mg·mL－1；而GDF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC亦均为0.2 mg·mL－1，对沙门氏菌的MIC为0.4 mg·mL－1.

2.3 抑菌时间对GDF和GDF-Zn抑菌效果的影响

由图2、3可知，抑菌时间对GDF和GDF-Zn的抑菌效果具有极显著影响(P＜0.01)，且在一定的抑菌时间内，二者的抑菌率均与抑菌时间呈正相关关系.GDF对金黄色葡萄球菌的抑菌率在抑菌时间为8 h时达到最大值(91.67%±0.21%)，之后趋于平稳；而对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率在10 h时均达到最大值，抑菌率分别为(95.32±0.33)%、(89.50±0.45)%和(86.23±0.27)%，当抑菌时间超过10 h时后，GDF对这3种致病菌的抑菌率增大不显著(P＞0.05).GDF-Zn对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌率在抑菌时间为10 h时均达到最大值，分别为(98.72±0.35)%、(95.77± 0.25)%、(90.78±0.17)%和(88.40±0.23)%；抑菌时间超过10 h时后，抑菌率趋于平稳.

表2 GDF和GDF-Zn对4种菌的MIC1)Table 2 Minimum inhibitory concentration(MIC)of GDF and GDF-Zn on four kinds of bacterias

由于枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球是革兰阳性菌(G＋菌)，大肠杆菌和沙门氏菌是革兰阴性菌(G－菌)，因此可以推测GDF和GDF-Zn对G＋菌和G－菌均有明显的抑制作用，且二者对G＋菌的抑制作用强于G－菌.这可能与细菌的细胞壁结构和组分有关，G＋菌的细胞壁厚且坚韧，其主要成分是肽聚糖，并结合磷壁酸(G－菌无此成分)，其肽聚糖为质地坚韧、紧密编织三维网络结构，GDF和GDF-Zn能够与肽聚糖、磷酸基团结合，从而破坏细胞壁造成细胞死亡；G－菌的细胞壁由外壁层和内壁层构成，外壁层含脂蛋白、脂多糖和脂质双层，内壁层肽聚糖少，厚度薄，平面结构，使其不容易与GDF、GDF-Zn结合.因此，G＋对GDF和GDF-Zn的敏感度比G－高.

3 讨论与结论

现代研究表明，植物类黄酮具有较强的抑菌效果，是一类良好的抑菌剂，其抑菌活性与其芳环上的羟基位置和数量有关[19].类黄酮的分子结构具有超强离域度，且带有含孤对电子的基团，如羰基、羟基或羧基等，故可与金属离子发生络合反应.大量研究证明，类黄酮与金属离子络合后，理化性质(如溶解度、共轭结构、氧化还原电势、电离度、诱导效应、表面张力等)发生了显著的变化，从而使其生物活性也发生变化.由于类黄酮与金属离子络合后，其结构和性质发生改变，导致其与蛋白质或DNA结合能力增强，从而使络合物的抗菌效果强于其配体.本试验结果显示，GDF和GDF-Zn均具有较强的抑菌活性，且GDF-Zn抑菌能力优于GDF，证实了前人的试验结果[20].

本试验以0.05%山梨酸钾为阳性对照，比较分析了GDF和GDF-Zn的抑菌活性，定性和定量抑菌试验的结果表明:GDF和GDF-Zn对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有显著抑制效果(P＜0.05)，并均强于0.05%山梨酸钾，GDF-Zn的抑菌能力强于GDF，且二者均对G＋菌的抑制作用强于G－菌.GDF对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的MIC和抑菌圈直径分别为0.20、0.40、0.20、0.10 mg·mL－1和(19.5±0.8)、(17.8±0.3)、(19.0±0.2)、(22.2±0.1)mm，GDF-Zn则分别为0.20、0.20、0.20、0.10 mg·mL－1和(20.1±0.5)、(18.1±0.7)、(19.3±0.2)、(24.5±0.8)mm.在试验范围内，随着样液与菌悬液作用时间的增长，抑菌率极显著增大(P＜0.01)，GDF与金黄色葡萄球菌作用8 h时抑菌率达到最大值，与其他3种菌悬液作用时间达10 h时抑菌率亦均达最大；而GDF-Zn对4菌种的最大抑菌时间均为10 h.

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(责任编辑:施晓棠)

Antibacterial activity of Gnaphlium affine flavonoids and flavonoids-Zn(Ⅱ)complex

LIN Huating，LÜ Feng，HUANG Guochao
(College of Food Science，Fujian Agriculture and Foresty University，Fuzhou，Fujian 350002，China)

Antibacterial activity and minimum inhibitory concentrations(MIC)of Gnaphlium affine D.Don flavonoids(GDF)and flavonoids-Zn(Ⅱ)complex(GDF-Zn)against Staphylococcus aureus，Salmonella lignieres，Escherichia coli and Bacillus subtilis were determined and compared by filter paper disc method and dilution method.Furthermore，the effect of antibacterial time on antibacterial activity was studied.The results showed that both GDF and GDF-Zn had significant antibacterial activity against 4 kinds of bacteria，and GDF-Zn was averagely more effective than flavonoids.The longer the antibacterial time the higher antibacterial rate was，with the maximum antibacterial rate being around 8－10 h.In addition，GDF and GDF-Zn had stronger inhibition effect on gram-positive bacterium than gram-negative bacterium.MICs of flavonoids on 4 kinds of bacteria were 0.20，0.40，0.20，0.10 mg· mL－1，respectively，and those of GDF-Zn on bacteria were 0.20，0.20，0.20，0.10 mg·mL－1，respectively.

Gnaphlium affine flavonoids；flavonoids-Zn(Ⅱ)complex；antibacterial activity

TS201.3

:A

:1671-5470(2016)06-0680-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.06.012

2016－01－11

:2016－07－19

福建省自然科学基金资助项目(2012J01081).

林华婷(1990－)，女，硕士研究生.研究方向:食品化学与营养.Email:765694310＠qq.com.通讯作者吕峰(1964－)，女，教授、硕士生导师，博士.研究方向:天然产物的综合利用、农产品加工及贮藏.Email:Yongyi64＠qq.com.