鸡爪苓菌丝体与子实体的全长cDNA文库构建及部分EST序列分析

蒋雨函, 许广波, 梁运江, 李太元, 李美善, 李艳茹

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

鸡爪苓菌丝体与子实体的全长cDNA文库构建及部分EST序列分析

蒋雨函, 许广波, 梁运江, 李太元, 李美善, 李艳茹*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

构建长白山药用真菌鸡爪苓菌丝体和子实体cDNA文库并测序，发掘鸡爪苓菌丝体和子实体发育中差异表达的基因；通过同源性比对，分析与陕西猪苓的亲缘关系，确立长白山鸡爪苓的分类地位。结果表明：鸡爪苓菌丝体和子实体cDNA文库滴度分别为1.504×1010pfu/mL和1.094×1010pfu/mL。从菌丝体cDNA文库选取500个克隆，经测序获得452个高质量表达序列标签(EST)，序列拼接出的单一基因簇包含310个单一基因；从子实体cDNA文库中选取的500个克隆，经测序获得472个高质量表达序列标签，序列拼接出的单一基因簇包含350个单一基因。从菌丝体和子实体cDNA文库中发掘的单一基因簇中，分别有39.3%和35.4%的基因与已知功能基因具有同源性，这些基因涉及细胞生长、信号转导、蛋白质合成、转录、抗逆反应以及能量代谢等。

鸡爪苓；全长cDNA文库；表达序列标签；功能注释

猪苓(Polyponusumbellatus(Pers.) Fr)是一种药用真菌，分地下生长的菌核和露出地表的子实体2部分[1]。我国陕西、云南、四川等省和东北长白山区是猪苓主要分布区域。从菌核的形态上可把猪苓划分为猪苓和鸡爪苓；猪苓菌核体形较大、形似猪粪、分枝少、表面较光滑；而鸡爪苓菌核块细小，形似鸡爪、分枝多、呈饼状[2-5]。Xing等(2013年)[6]对产自吉林长白山和陕西秦岭的猪苓菌核进行了 nrDNA ITS 和 28S rRNA(LSU)序列的比对分析，认为产于长白山的鸡爪苓和产于陕西等地的猪苓之间存在种内遗传差异，提出长白山鸡爪苓应列为单独类群。

表达序列标签(Expressed sequence tags，EST)是从已构建的cDNA文库中随机选择克隆，进行5′-端和3′-端测序获得的短片段cDNA序列，是一个完整基因的一小部分[7-9]。廖鏖等(2014年)[10]和栾换东等(2015年)[11]对鸡爪苓菌丝体和子实体分别进行了cDNA文库构建，并在Nr/Nt数据库中进行了Blast初步分析，找到了一小部分同源性基因。目前，关于猪苓cDNA文库构建和EST序列分析方面的研究还很少，在NCBI数据库可查寻的猪苓EST只有264条。

本研究拟在构建鸡爪苓菌丝体和子实体2个生长阶段的高质量全长cDNA文库的基础上，通过测序获得表达序列标签，并对其进行功能注释，为阐明鸡爪苓菌丝体和子实体2个生长发育中基因表达的差异、发掘参与鸡爪苓菌丝体生长发育与子实体发生相关的重要基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡爪苓菌丝体由采自吉林省安图县的鸡爪苓菌核经组织分离后培养获得，经纯化扩繁后保存于延边大学微生物实验室。鸡爪苓子实体采自吉林省蛟河市天南乡解放村，新鲜的子实体经冷藏保鲜带回实验室后用液氮冷冻处理备用。

1.2 鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库的构建及其测序

菌丝体和子实体总RNA的提取参照 Trizol reagent 说明书进行操作；用改进的SMARTTM法[12]合成cDNA，通过LD-PCR扩增cDNA；经蛋白酶K消化、Sfi I酶切和CHROMA SPIN-400分级分离cDNA和构建鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库。用 λ Triple × 2噬菌体包装，统计菌落总数和蓝白菌落数，对原始文库进行文库滴度和重组率的测定。再分别从菌丝体和子实体cDNA文库中各随机挑取500个克隆送至上海生工生物工程股份有限公司(长春分公司)进行测序。

1.3 EST序列的预处理

利用Chromas软件分析cDNA序列峰图，手动去掉800 bp下游序列部分；再利用NCBI网站中的VecScreen工具快速去除cDNA中的载体序列部分后，再使用Seqman程序对有效序列进行聚类拼接。

1.4 EST的功能注释

将聚类拼接得到的EST有效序列，利用NCBI网站的核酸库Nt和蛋白库Nr进行BLASTN或BLASTX比对，E值设为1e-5。使用GO(Gene Ontology，基因本体论)数据库对鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库的EST进行功能分类注释，获得分子功能、生物学过程和细胞组分等3方面的注释信息。

1.5 系统进化树构建

鸡爪苓系统进化树的构建，采用MEGA6.05软件中的NJ法。

2 结果与分析

2.1 鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库的质量鉴定

构建的鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库，经测定，菌丝体的cDNA原始文库滴度为1.66×106pfu/mL，重组率为96.7%；扩增后，文库的滴度为1.50×1010pfu/mL，插入片段长度主要在500～2 000 bp(图1)。子实体的cDNA原始文库滴度为5. 63×106pfu/mL，重组率为98.7%；扩增后文库的滴度为1. 10×1010pfu/mL，插入片段长度主要在500～2 000 bp(图2)。说明构建的鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库均达到建库的预期标准。

M：DNA分子量标准；1-23：分别为文库中随机挑选出来的克隆

M：DNA分子量标准；1-24：分别为文库中随机挑选出来的克隆

2.2 测序

从鸡爪苓菌丝体和子实体cDNA文库中分别随机挑选500个克隆进行单向测序，共获得452和472条高质量序列，平均长度为561和555 bp(表1)。

表1 菌丝体和子实体cDNA文库的ESTs

Table 1 ESTs from cDNA library of mycelium and fruit body

描述项数目菌丝体子实体ESTs总数/条500500 空载体序列/条251 低质量序列/条2327 有效的ESTs/条452472有效ESTs平均长度/bp561555包含contigs的ESTs数目/条207201重叠群/条6579单拷贝EST/条245271单基因簇/条310350冗余度/%3126

通过聚类并对同一重叠群进行拼接，菌丝体文库中一共获得了65个含1条以上EST的重叠群和245条仅含1条EST的单一序列，即代表了310条单基因簇，文库的冗余度为31%；子实体文库中一共获得了79个含1条以上的EST的重叠群和271条仅含1条EST的单一序列，即代表了350条单基因簇，文库的冗余度为26%。

2.3 EST序列注释

按高瑞娟(2003)、[13]崔永兰(2004)[14]、cason等(2002)[15]和Crookshankst等(2001)[16]的EST序列注释法，根据BLAST所得序列一致性，将EST划分为3大类，E值 < 10-5且编码己知蛋白的属于“功能己知基因”类 ；编码推测的和未知蛋白质的EST属于功能未定的“假定蛋白质” 类 ； 而E值>10-5及注释结果为缺乏显著相似性的EST被认为是可能的新基因片段，纳入“无显著相似性”基因(表2)。

表2 EST的BLAST搜索及其同源蛋白分类

功能已知基因其功能涉及细胞生长、信号转导、蛋白质合成、转录、抗逆反应以及能量代谢，选择覆盖率95%以上或95%的EST列入表中(表3，4)。

对基因的功能注释结果表明，鸡爪苓菌丝体和子实体全长cDNA文库中参与蛋白质合成和能量代谢的基因较多，而且同源物种多数为真菌。

表3 已知功基因同源的菌丝体ESTs

表4 已知功基因同源的子实体ESTs

续表4 已知功基因同源的子实体ESTs

2.4 基因功能分类

鸡爪苓菌丝体的基因GO注释结果见图3。

由图3可知，仅有175条获得1条或1条以上GO术语，包括细胞组分、分子功能和生化过程3个层次。细胞组分包括8个部分，分子功能包括2个部分，生化过程包括17个部分。鸡爪苓子实体的基因GO注释结果，仅有188条获得1条或1条以上GO术语，亦包括细胞组分、分子功能和生化过程3个层次。细胞组分包括6个部分，分子功能包括3个部分，生物学过程包括19个部分(图3)。在细胞组分(cellular component)中，菌丝体在包膜(envelope)和细胞器(organelle part)上单独表达，子实体在胞外部分(extracellular region part)上单独表达。在分子功能(molecular function)中，子实体在输送体(transporter)上单独表达。在生化过程中(biological Process)中，子实体在生物附着(biological adhesion)和生长(growth)上单独表达。可见，鸡爪苓在菌丝体和子实体的2个生长阶段存在着基因表达上的差异。

图3 鸡爪苓菌丝体和子实体基因的GO功能注释

2.5 鸡爪苓的进化亲缘关系

从鸡爪苓的系统进化关系(图4)来看，长白山鸡爪苓(chicken-claw-shapedPolyporusumbellatus)与云芝(TrametesversicolorFP-101664SS1)、革菌(PunctulariastrigosozonataHHB-11173SS5)、污叉丝孔菌(DichomitussqualensLYAD-421SS1)和灰盖伞菌(Coprinopsiscinereaokayama7*130)的进化关系较近；而陕西猪苓(Polyporusumbellatus)和立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniAG-1IA)的进化关系较近。虽然长白山鸡爪苓与陕西猪苓在传统分类学上都划归猪苓，但本研究中所构建的系统进化树中处于不同的递进分枝中(图4)；说明长白山鸡爪苓和陕西猪苓在进化上存在较大分化，2者之间在遗传上存在较大差异。

图4 不同真菌系统进化树

3 讨论与结论

亚种通常是一个物种因地理隔离导致缺乏基因流所致，若进一步分化，甚至成为新的物种。从系统进化关系来看(图4)，长白山区鸡爪苓和陕西猪苓分别位于不同的分枝中，长白山区鸡爪苓菌与云芝、革菌、污叉丝孔菌及灰盖伞菌在进化上关系较近，而与陕西猪苓在进化上关系较远，这与Xing等(2013)的研究结果一致。说明鸡爪苓是长白山区特异的猪苓种质资源，不仅在菌核形态上与陕西猪苓差别很大，而且在遗传上也存在较大差异。

本研究成功构建了鸡爪苓菌丝体和子实体2个cDNA文库，分别获得452和472条高质量EST序列，并分别发掘出310和350条单一基因(unigene)。在菌丝体文库中267条单一基因和子实体文库中316条单一基因与NCBI数据库中的相关基因有同源性；但有13.9%的鸡爪苓菌丝体单一基因(43个)和9.7%的鸡爪苓子实体单一基因(34个)在NCBI公共数据库中未能搜索到与之相关的基因。由于NCBI数据库中包含的基因数量和信息量非常庞大，本研究中所发掘的未知基因很有可能是鸡爪苓特异表达的基因，在鸡爪苓生长过程中具有重要功能。总之，目前在共享生物信息数据库中关于猪苓的基因和基因组序列信息相对较少，本研究通过EST分析结果进一步丰富了鸡爪苓基因组信息，为全面了解鸡爪苓菌丝和子实体形成的分子机制奠定了理论与实验基础。

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Construction and EST sequence analysis of full-length cDNA library of mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shaped Polyporus umbellatus in the Changbai Mountain area

JIANG Yuhan, XU Guangbo， LIANG Yunjiang， LI Taiyuan， LI Meishan， LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

The cDNA library from the mycelia and fruit body of medicinal fungus chicken-claw-shapedPolyporusUmbellatusin Changbai Mountains was constructed and sequenced, and the genes differentially expressed between mycelium and fruit body were explored.In addition, by homologous analysis, its genetic relationship to ShǎnxiPolyporusUmbellatuswas determined and, its taxonomical status was established. The results showed that the titers for cDNA libraries of mycelium and fruit body were 1.504×1010pfu/mL and 1.094×1010pfu/mL,respectively. A total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of mycelium producted 452 high quality ESTs and, from which 310 unigenes were annotated, whereas a total of 500 clones randomly selected from the cDNA library of fruit body produced 472 high quality ESTs and, from which 350 unigenes were annotated. Among the unigenes from cDNA libraries of mycelium and fruit body, approximately 44.5% and 42.6% of unigenes were homologous to the known genes concerned with cell development, signal transduction, protein synthesis, transcription, tolerance response to stress and energy metabolism.

chicken-claw-shaped polyporus umbellatus；cDNA library；EST；annotation

2016-10-20 基金项目：国家自然科学基金项目(31160014)

蒋雨函(1993—)，女，吉林四平人，在读硕士，研究方向为药用真菌学。李艳茹为通信作者，

E-mail：gbxu@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)04-0277-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.04.001

S567.3

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