粮食中赭曲霉毒素A提取方法的改进

李峰

（山西粮食质量监测中心，山西太原030024）

粮食中赭曲霉毒素A提取方法的改进

李峰*

（山西粮食质量监测中心，山西太原030024）

赭曲霉毒素（Ochratoxins）是由真菌产生的一组结构类似的、有毒的次级代谢产物，主要危害人和动物的肾脏。赭曲霉毒素有A、B、C、D 4种化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒最高，对农作物污染最重，与人类健康密切相关的是赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)。OTA的主要产生菌是赭曲霉（Asperillus ochraceus）和纯绿青霉（Penicillium verrucosum）。OTA对食品污染范围较广，包括谷物、咖啡豆、豆类、可可豆、葡萄干、啤酒和葡萄汁等，OTA还可通过母亲的血液转入到乳汁中。1993年国际癌症研究机构（The Interna-tional A-gency for Research on cancer，IARC）已将OTA列为可能的人类致癌物。

本文以小麦中OTA的提取方法为例进行探究，主要参考标准包括：GB/T 2761—2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素的限量》、GB/T 23502—2009《食品中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》、GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》。GB/T 23502—2009中给定的提取方法得到的回收率较低，因此本试验结合国标方法和免疫亲和柱操作手册对GB/T 23502—2009中提取OTA的方法进行了改进，使回收率得到提高。本方法净化效果好、准度高、重现性好，可以满足粮食中OTA的限量检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

日立L-2000四元梯度高效液相色谱仪，包含日立L-2485包含荧光检测器、日立L-2200自动进样器、日立L-2300柱恒温箱、日立L-2130泵；高速分散均质机，IKA T25 digital ULTRA-TURRAX；YP402N电子天平；TGC-16WS台式高速离心机；氮吹仪，北京斯珀特科技有限公司；250 mL三角瓶。

1.2 试剂

乙腈、甲醇，均为色谱级；乙酸、氯化钠、碳酸氢钠，均为分析纯；超纯水，艾科浦超纯水系统生产。

真菌标准品：OTA标准溶液，质量浓度100 μg/mL，由Pribolab Pte.Ltd生产。

标准工作液：质量浓度分别为1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L。

提取液：1%碳酸氢钠-甲醇-水（80%甲醇+20%水）混合溶液。

免疫亲和柱：IAC-SEP OTA免疫亲和柱，由中检维康生产，柱体积3 mL（适用于手工加液，以自然流速流下），柱容量100 ng。

1.3 色谱条件

色谱柱：依利特-C18，4.6 mm×150 mm(5 μm)；流动相：乙腈∶水∶乙酸（99∶99∶2）；流速：0.9 mL/min；检测器：荧光检测器，激发波长333 nm，发射波长477 nm；进样体积：30 μL；柱温：40℃。

1.4 加标量的确定

根据GB 2761—2011中各产品OTA的限量点为5 μg/kg，加标量点确定为限量点的25%、50%、100%，即25 g样品中加入OTA的量分别为31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng。

1.5 优化条件确定

1.5.1 洗脱时间对回收率的影响

以小麦中OTA限量点的100%加标，按照GB/T 23502—2009中的要求加入1.5 mL无水甲醇进行洗脱，平均回收率为54.7%，改良方法中甲醇体积增加到2 mL，平均回收率提高至63.1%，结果见表1。

表1 不同洗脱体积加标回收率

1.5.2 碱液质量浓度对回收率的影响

OTA易溶于极性有机溶剂和碱性溶液，向GB/T23502—2009中提取液甲醇-水混合液加入一定量的碱液进行试验，取3个水平质量浓度的碳酸氢钠-甲醇-水混合液质量浓度分别为0.5%、0.7%、1.0%进行提取，并用1.5 mL洗脱液洗脱，其中1.0%的碳酸氢钠-甲醇-水混合液已达到饱和状态。结果显示，在0.5%、0.7%的碱性溶液中，加标回收率并没有提高，但碱液质量浓度加大到1.0%时，回收率显著提高，结果见表2。

表2 各水平质量浓度加标回收率

1.5.3 均质时间对回收率的影响

GB/T23502—2009中规定样品均质时间为3min，对两组加标样分别均质3 min、4 min，均质机转速均为10 000 r/min，结果见表3。由表3可知，加标回收率在均质4 min时有大幅度提高。

表3 不同均质时间加标回收率

1.5.4 过滤优化

国标方法中规定过滤OTA提取液时要用玻璃纤维滤纸，但是玻璃纤维滤纸成本高，普通滤纸易吸附目标物，且在过滤粉状样品时易堵塞，液体难以流下。因此，本试验采用离心法分离OTA提取液，效果良好。

1.5.5 优化条件结论

小麦OTA测定加标回收试验中，提取液为质量浓度1%的碳酸氢钠-甲醇-水混合液，均质时间4 min，均质机转速10 000 r/min，洗脱液体积取2 mL为最终改进试验条件。

1.6 提取与净化

准确称取25 g样品置于250 mL的三角瓶中并加标，加入140 mL提取液，在转速10 000 r/min的均质机中提取4 min，静置5 min。吸取8 mL上层液置于10 mL离心管中，10 000 r/min离心10 min。

取5 mL离心后上清液，加入20 mL超纯水混匀，静置5 min后，取10 mL混合液通过免疫亲和柱，流速控制在1～2滴/s，液体全部流出后，再用20 mL超纯水以流速1～2滴/s清洗柱子，并将最后一滴水全部吹出。

最后用2 mL无水甲醇洗脱免疫亲和柱并收集洗脱液，将最后一滴甲醇全部吹入至收集管中，在60℃下用氮气吹干，加入1 mL流动相定容，混匀后利用高效液相色谱仪进行测定。

2 结果与分析

2.1 标准色谱图和线性范围

在上述色谱条件下，OTA的标准品色谱图如图1所示。

图1 OTA的标准品色谱图

将配制好的标准工作液做线性回归分析，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标得到OTA的线性方程和相关系数，Y=26 055X+2 377.9，R2= 0.999 9，线性范围1 μg/L～50 μg/L，OTA标准曲线如图2所示。

图2 OTA标准曲线图

2.2 样品加标回收测定

2.2.1 样品加标色谱图

本试验以小麦OTA限量点为基准，分别向3组样品添加OTA，加标量分别为31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng，每组样品做3个平行。小麦空白基质及加标样品色谱图分别见图3、图4、图5、图6。

图3 小麦空白基质色谱图

图4 小麦OTA加标量为31.2 ng色谱图

图5 小麦OTA加标量为62.5 ng色谱图

图6 小麦OTA加标量为125.0 ng色谱图

2.2.2 回收率试验

向小麦基质中添加OTA的量分别为31.2 ng、62.5 ng、125.0 ng，三组平行加标回收率结果见表4。

表4 小麦基质不同加标量的回收率

同时按照此方法还做了玉米、大豆、小麦粉、玉米的OTA加标回收试验，OTA的平均回收率（%）见表5。

表5 各种产品基质不同加标量的回收率

3 结论

本文主要对粮食中OTA的提取和净化方法进行了对比、研究。在GB/T 23502—2009中OTA提取净化的基础上结合试验中的具体操作进行了优化和改进，最终将OTA回收率从54.8%提高到95.0%。本方法净化效果好，分析灵敏、可靠、准确度和精密度较高，能够应用于粮食中OTA的检测工作，满足分析要求，有参考应用价值。

［1］RATOLA N，MARTINS L，ALVES A.Ochratoxin A in winesassessing global uncertainty associated with the results［J］. Analytica Chimica Acta，2004，513:319-324.

［2］LEITNER A，ZOLLENER P，PAOLILLO A，et al.Comparison of methods for the determination.of ochratoxin A in wine［J］.Analytica Chimica Acta，2002，453:319-324.

Study on extraction method of ochratoxin Ain crop

LI Feng*
（Shanxi crop monnitoring center，Shanxi Taiyuan 030024，China）

根据赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）易溶于极性有机溶剂和碱性溶液的特性，利用碱性甲醇-水混合液提取粮食中的OTA，并通过免疫亲和柱提取纯化，采用高效液相色谱法进行测定。试验结果表明，方法改进后OTA的回收率提高到80%～96%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》规定要求。

赭曲霉毒素A；高效液相法；回收率

Ochratoxin A easily dissolved in organic solvent and alkaline solution,so the method was developed for the determination of ochratoxin A in crop by high performance liquid chromatography after alkaline methanol-water mixed solution extraction,immunoaffinity column clean-up.The results showed that the average recovery rate of ochratoxin A wereimproved to80%～96%.Theimproved method compliedwith specified requirementsofGB/T27404-2008.

ochratoxin A；high performance liquid chromatography；average recovery rate

表4 3种质量浓度加标回收率

TS207.5+3

A

1673-6044（2016）04-0055-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.015

*李峰，男，1984年出生，2009年毕业于河南工业大学食品科学与工程专业，助理工程师。

2016-10-21