丛台酒大曲中高产淀粉酶细菌的分离和鉴定

王鑫昕，耿霄，吴子龙，王磊

（邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸056000）

丛台酒大曲中高产淀粉酶细菌的分离和鉴定

王鑫昕，耿霄，吴子龙，王磊

（邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸056000）

为从丛台酒中温大曲中分离高产淀粉酶的菌株，通过透明圈法和淀粉酶活力测定分别进行了初筛和复筛，并通过生理生化性能鉴定确定高产淀粉酶细菌的分类。经筛选得到的高产淀粉酶细菌C3，其淀粉酶活力为63.1U，比原厂浓香型大曲提高了44.4%。经鉴定，C3为革兰氏阳性芽孢杆菌，其菌落为黄褐色，表面无光泽、不透明且边缘整齐，有不规则突起。对丛台酒高产淀粉酶细菌的分离，将为酒厂提高大曲质量和出酒率提供菌种和依据。

大曲；淀粉酶；细菌；分离；鉴定

在酿造过程中加入酒曲是我国白酒酿造的显著特点[1]。大曲是酿酒微生物和酶的载体，其内部微生物种类十分复杂，主要包括三大类即霉菌、细菌和酵母菌[2]，这些菌起到利用原料产香、产酸、产酒的作用，影响着白酒的产量，赋予了白酒不同的风味和口感，因而有“曲是酒之骨”之说。白酒大曲中的微生物，传统的方法是从自然界自然接种而来，在近代微生物学发展后，可由人工选育接种。大曲微生物的人工加入能够增加酒的产量或丰富酒的风味，因此人工选育微生物可以让白酒生产按照工艺设定目标进行。近年来，有关白酒大曲微生物的研究日益增多，主要集中在对酒曲微生物的种类、数量及其与酒曲理化性质关系的研究[3-4]，以及对酒曲中优良菌株的选育等方面[5-7]。有关丛台酒中细菌的研究在本文之前未见报道。本研究以丛台酒中温大曲作为研究对象，首次对成熟曲中高产淀粉酶的细菌进行分离并初步鉴定，以备为后续大曲液化力、糖化力的提高及发酵力等其他指标的平衡关系的研究提供菌种，为大曲的发酵培养工艺控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

河北省邯郸市丛台酒业提供的成熟中温大曲。

1.2 培养基

淀粉培养基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，20 g琼脂，加水至1 L，121℃灭菌20m in。

种子培养基：10 g蛋白胨，5 g NaCl，3 g牛肉膏，2 g可溶性淀粉，加水定容至1 L，121℃灭菌20m in。

产酶发酵培养基：80 g玉米粉，5 g蛋白胨，40 g豆饼粉，5 g K2HPO4，3 g(NH4)2SO4，5 g Na2HPO4，加水定容至1 L，121℃灭菌20m in。

柠檬酸钠培养基：2 g柠檬酸钠，5 g NaCl，0.1 g Mg-SO4·7H2O，1 g(NH4)2HPO4，1 g K2HPO4·3H2O，溴百里酚蓝水溶液100m L，20 g琼脂，121℃灭菌20m in。

肉汤培养基：1 g蛋白胨，0.5 g NaCl，0.3 g牛肉膏，2 g琼脂，加水定容至100m L，121℃灭菌30m in。

1.3 产淀粉酶细菌的初筛和复筛

无菌环境中，称取曲皮（距大曲表面1 cm处）、曲心（距曲块中心1 cm处）各5 g，研磨后加入10m L无菌水中振荡1m in，经过滤后取滤液1m L加入到9m L无菌水中，振荡混匀，得到10-1菌悬液。经逐级稀释后，依次得到10-2、10-3……10-6的梯度稀释液。

取10-5、10-6稀释菌悬液各100μL涂布在淀粉培养基上，并置于30℃倒置培养2 d。之后，对每个生长出单菌落的培养皿进行碘熏，并将有明显透明圈的单菌落挑出，接种到淀粉培养基斜面，30℃培养48 h。观察菌落形态特征，4℃冰箱保存备用。

从斜面培养基挑取单菌落，接种到液体种子培养基中，在30℃摇床150 r/m in振荡培养24 h，然后将种子液以10%的接种量接种于产酶发酵培养基上，30℃、150 r/m in振荡培养24 h。取培养液测定淀粉酶活力，得到其中酶活力最大的菌株为高产淀粉酶菌株。

1.4 产淀粉酶细菌的生理生化性能鉴定

柠檬酸盐利用实验：用接种针挑取复筛的高产淀粉酶菌株，穿刺接种在柠檬酸盐培养基试管斜面上，另取一相同柠檬酸盐培养基试管斜面不接种，作对照组。将2支试管以30℃培养48 h，观察菌落形态。

细菌耐热性：将筛选出来的细菌接种到种子培养基中，30℃培养24 h，再将菌液放入60℃水浴中30m in，最后取1m L菌液涂布在淀粉培养基平板上，30℃培养24 h。另取未经水浴的1m L菌液涂布于同样的淀粉培养基平板上，作为对照。

过氧化氢酶产生实验：将复筛的高产淀粉酶菌株接种在肉汤培养基平皿中，30℃培养24 h。将H2O2溶液滴加到平皿上生长出的菌落上，观察记录结果。

1.5 淀粉酶活力的测定

取1.3中产酶发酵培养基培养24 h后的5m L培养液，5000 r/m in离心10m in，取上清液作为测定淀粉酶活力的酶液。5m L淀粉溶液以40℃水浴10m in，再加入0.5m L已经稀释10倍的酶液，反应5m in后，加入5m L H2SO4溶液终止反应。

另取5m L工作碘液于新试管中，然后取0.5m L上述反应液混合进行显色反应。用620 nm波长可见光分光光度计测定吸光度值，并计算各试管的酶活力。以0.5m L水代替0.5m L反应液为空白，以不加酶液(加相同的水)的管为对照。

定义酶活力单位：40℃、5 m in内水解1 mg淀粉(0.5%淀粉)的酶量定义为1个活力单位（U）。

酶活力计算公式：

其中，Rt表示对照组吸光度值，R代表反应液的吸光度值，D为酶液的稀释倍数，实验过程要调节D值使(Rt-R)/Rt在0.2～0.7。从中筛选出吸光值最小，即酶活力最强的菌株。

2 结果与分析

2.1 大曲中产淀粉酶菌株的初筛结果

按照1.3的方法，丛台酒中温大曲样品经培养得到单菌落，在进行碘熏后对有透明圈的单菌落进行形态观察，共得到主要7种菌落形态，见图1和表1。

2.2 大曲中产淀粉酶菌株的复筛结果

按照1.5的方法对初筛的7株产透明圈菌株测淀粉酶活力，所得的结果见表2。可见B3、C1、C3的淀粉酶活力较强，其中B3和C1分别为41.3U和46.6U，与原厂浓香型大曲的淀粉酶活力相近。以C3菌株产淀粉酶活力为最高，为63.1 U，与原厂浓香型大曲的淀粉酶活力（表2中对照）相比，提高了44.4%。

2.3 对高产淀粉酶细菌的生理生化性能鉴定

2.3.1 革兰氏染色实验

图2为C3菌的革兰氏染色结果，从显微镜下可见菌细胞形态为杆状，染色结果显示紫色，因此确定C3为革兰氏阳性杆菌。

2.3.2 柠檬酸盐利用实验

图1 具有透明圈的单菌落

表1 菌落形态特征

表2 淀粉酶活力测定结果

图2 革兰氏染色结果

接种了C3菌培养24 h后，柠檬酸盐实验培养基的颜色，由对照组的草绿色转变成蓝色，见图3。这说明C3菌可利用柠檬酸钠。根据柠檬酸钠可以被大多数芽孢杆菌利用这一性质，继续进行如下实验。

2.3.3 测定过氧化氢酶产生实验

滴加过氧化氢到培养C3的培养基上，发现培养基表面会不时的产生气泡，说明C3菌能够产生分解过氧化氢的酶。由于芽孢杆菌都能产生过氧化氢酶，因此可判断C3菌可能为芽孢杆菌。

图3 柠檬酸盐利用实验结果

2.3.4 耐热性实验

C3菌经60℃水浴30m in后，得到与对照相同的结果：发现涂布的平板上布满细菌，可见的单菌落在300个以上。因此C3菌是耐热的芽孢杆菌。

3 结论

经过对丛台酒成熟中温大曲中的细菌进行初筛和复筛，筛选出C3菌为高产淀粉酶的细菌，其淀粉酶活力为63.1 U，与原厂浓香型大曲的相比，其淀粉酶活力提高了44.4%。C3为革兰氏阳性芽孢杆菌，其菌落为黄褐色，表面无光泽、不透明且边缘整齐，有不规则突起。

[1]侯小歌,杜小波,李学思,等.中温大曲中乳酸菌的分离鉴定及产酸特性[J].酿酒科技,2010(9)：17-24.

[2]张中义,畅晓霞,钟其顶.酒曲酶系、菌系特征及酿造过程中微生物动态变化[J].酿酒,2008,35(5)：24-29.

[3]唐玉明,张正英,任道群,等.曲外层和曲心的微生物数量生化性能及酿造效果研究[J].酿酒科技,1995(3)：73-76.

[4]姚万春,唐玉明,张正英,等.泸型陈曲贮存期微生物酶类的变化及酿造效果[J].酿酒科技,1996(4)：19-20.

[5]唐玉明,廖建民,姚万春,等.浓香型曲药功能菌选育及利用研究[J].酿酒科技,1998(3)：22-24.

[6]廖建民,唐玉明,姚万春,等.浓香型曲药微生物的分离与筛选研究简报[J].酿酒,2000,136(1)：36-38.

[7]廖建民,任道琼,唐玉明,等.浓香型曲药中酵母菌的初步分类和选育[J].酿酒,2000,137(2)：47-48.

Isolation and Identification of a Bacteria Strain with High Yield of Amylase from Congtai Daqu

WANG Xinxin,GENG Xiao,WU Zilong and WANG Lei
(Department of Life Science and Engineering,Handan Colleage,Handan,Hebei056000,China)

In this study,transparent circle method and amylase activity measurement were adopted respectively for primary screening and secondary screening of bacteria strains with high yield of amylase from Congtai Daqu.As a result,strain C3 with high yield of amylase was obtained and its amylase activity reached up to 63.1 U,44.4%higher than that of the original Daqu.Through physiological and physiochemical identification,strain C3 was identified as gram-positive Bacillus and its single colony was yellowish-brown with matt surface,neat edge and irregular convex.This study provided reference for obtaining useful bacteria strains in distilleries to improve Daqu quality and liquor yield.

Daqu;amylase;bacteria;isolation;identification

Q93-3；TS261.1；TS262.3；TQ920

A

1001-9286（2017）01-0030-03

10.13746/j.njkj.2016325

邯郸市科学技术研究与发展计划项目(1523103064-5)。

2016-11-03

王鑫昕(1982-)，女，河北邯郸人，讲师，主要从事生化和发酵生产研究。

优先数字出版时间：2016-12-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161202.1106.002.html。