浓香型白酒固态发酵工艺对稻壳抗降解屏障的影响

王丹丹，王立英，魏玉西，崔球，孙志杰

(1.青岛大学生命科学学院,山东青岛266071；2.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛266101)

浓香型白酒固态发酵工艺对稻壳抗降解屏障的影响

王丹丹1，2，王立英2，魏玉西1，崔球2，孙志杰2

(1.青岛大学生命科学学院,山东青岛266071；2.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛266101)

以浓香型白酒固态发酵工艺为研究对象，分析了稻壳经浓香型白酒固态发酵工艺处理前后的成分变化，并考察了浓香型白酒固态发酵工艺对稻壳高温水热预处理效果以及纤维素酶酶解效率的影响，结果显示经浓香型白酒固态发酵工艺处理后：（1）稻壳的纤维素含量和结晶度以及木质素和灰分含量发生显著改变；（2）稻壳半纤维素和酸不溶性木质素的高温水热抽提效率显著上升，并且半纤维素降解产物的聚合度明显降低；（3）再经高温水热预处理的稻壳纤维素酶酶解效率可提高2倍之多。结果表明，中国传统的白酒固态发酵过程是一个既可生产高附加值目的产物（白酒）又具有高效木质纤维素预处理能力的长期生物加工过程。

浓香型白酒固态发酵工艺；稻壳；抗降解屏障

发展以木质纤维素为原料的生物炼制技术是实现我国稻壳资源高值化利用的关键途径，然而,稻壳固有的抗降解屏障导致其木质纤维素产可发酵糖的高成本和低效率[1]。为解除稻壳的天然抗降解屏障，研究人员已开发了多种基于物理、化学和生物原理的预处理方法[2-3]。在众多现有的稻壳预处理方法中，虽然生物预处理过程具有能耗低、反应条件温和、预处理物料消耗低和无环境污染的优点，但这种单纯以破坏木质纤维素抗降解屏障为唯一目的的生物预处理方法面临着时间成本高和效率低的先天限制[4]。因此发展既具有高效生物质预处理能力，又能同时生产高附加值目的产物的长期生物加工过程是克服生物预处理缺点的可行途径。

以稻壳为辅料的固态发酵酿制白酒工艺是我国独有的传统酿酒方法，其最大特征是固态糖化发酵、固态蒸馏以及续渣发酵[5]。大曲中的天然微生物拌入酒醅后与来自于窖泥、空气以及水中的微生物群落结合形成了酒醅微生物区系，而酒醅微生物区系与周围微生态环境相互作用后形成了特殊的生物质降解群落。在动态复杂的白酒固态发酵体系内，多种不同功能的微生物群落在生物质降解的不同阶段，在合适的氧气浓度、温度、水活度和pH值条件下，利用无机营养物质和有机碳源生长繁殖，并分泌降解特定生物质成分的酶（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及纤维素酶、半纤维素酶等）及小分子物质（有机酸和过氧化物）作用于发酵原料，将淀粉、蛋白质、脂肪等大分子聚合物降解为自身可利用的营养物质,从而在生成醇、酸和酯等物质并形成各种具有独特风味白酒的同时，也完成了对发酵原料的降解[6-8]。

目前人们对白酒固态发酵体系的研究多集中于如何选育酿酒微生物、改造酒曲和发酵体系的酶系，以达到控制及优化白酒产量及品质[6-9]，而对于白酒固态发酵这一生物质降解体系的稻壳木质纤维素的降解能力及降解机制未见报道。由于白酒发酵产业在我国国民经济发展中占很大比重,深度发掘白酒固态发酵工艺在生物质预处理和生物质转化方面的应用潜力,将会大大增加稻壳的再利用，极大的提高产业的产品附加值。因此为阐明白酒固态发酵体系的木质纤维素降解能力，本研究以浓香型白酒固态发酵工艺为研究对象，考察了稻壳经浓香型白酒固态发酵工艺处理前后的成分变化，分析了浓香型白酒固态发酵工艺对稻壳高温水热预处理以及纤维素酶酶解效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

稻壳和浓香型白酒酒糟均来自于山东省青岛市琅琊台酒业集团。纤维素酶Ctec-2购自诺维信，淀粉酶和糖化酶均购自阿拉丁试剂公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 去淀粉白酒酒糟稻壳的制备

为消除白酒酒糟稻壳和原料稻壳携带淀粉对纤维素含量分析的干扰，实验首先应用淀粉酶和糖化酶对酒糟稻壳和原料稻壳进行去淀粉处理[10]，以碘化钾溶液作为淀粉指示剂，待样品颜色不变蓝后终止糖化处理。清洗去淀粉稻壳和酒糟稻壳，80℃烘干备用。

1.2.2 高温水热预处理

稻壳的预处理采用parr4848压力搅拌反应釜进行，在液固比为6∶1(m L/g)的条件下装入20 g稻壳(以绝干质量计)，在设定的最高温度以及保温时间条件下处理稻壳。蒸煮结束后，0.22μm微孔滤膜过滤样品，分别收集液相（抽提液）和固相（处理后稻壳）。固相样品用去离子水洗至中性后，一部分直接用于酶解实验，另一部分80℃烘干后用于测定处理后湿稻壳的干物质含量和组分分析。

1.2.3 稻壳组分和水热抽提液组分分析

稻壳及预处理后稻壳样品中纤维素、半纤维素、酸不溶性木质素、酸溶性木质素、灰分含量依照NREL标准方法TP-510-42620测定。稻壳样品结晶度通过X射线衍射仪(D8ADVANCE XRD，Bruker，USA)测得，测定电压40 kV，电流200m A，扫描角度范围为5～50°，扫描速率为0.2°/m in。

公式（2）中测定组分包括纤维素、半纤维素、酸溶性木质素、酸不溶性木质素和灰分。

1.2.4 水热抽提液中组分分析

准确量取70.5m L水热抽提液于玻璃耐压瓶中，加入1.5m L质量分数为72%的H2SO4溶液，混合均匀。将耐压瓶密封好，放在121℃的压力灭菌锅中反应1 h。反应结束后，将耐压瓶冷却至室温。取少量上清液，将其用0.22μm微孔滤膜过滤，将所得到的样品进行液相色谱分析，参照NREL/TP-510-42620的方法测得葡萄糖、阿拉伯糖、木糖以及酸溶性木质素含量，并依糖含量计算纤维素和半纤维素抽提率。木寡糖含量参照文献报道的方法测定[11]。

1.2.5 稻壳纤维素酶水解

准确称取相当于2 g绝干质量的预处理后的稻壳，放入250m L摇瓶内，加入0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲溶液和0.2m L叠氮化钠溶液(0.02 g/m L)，控制酶水解质量分数为2%，然后分别加入相当于20 FPU/g底物的诺维信Ctec-2纤维素酶。放入50℃恒温振荡培养箱内，在95 r/m in转速下振荡反应到设定的时间后，取上层清液测定葡萄糖含量。

2 结果与分析

2.1 浓香型白酒固态发酵过程可改变稻壳组成成分

为考察浓香型白酒固态发酵过程中稻壳生物质成分变化，本文首先分析了原料稻壳和酒糟稻壳的化学成分（见表1）。由表1可知，酒糟稻壳的纤维素含量和酸溶性木质素含量均显著低于原料稻壳，而酸不溶性木质素含量显著高于原始稻壳（P＜0.05）。同时分析也发现酒糟稻壳的半纤维素和灰分含量与原料稻壳无显著差异( P＞0.05)。X射线衍射（XRD）检测结果显示，酒糟稻壳的纤维素结晶度（29.43%±1.02%）显著（P＜0.05）低于原料稻壳（38.47%±1.27%）（图1）。

2.2 浓香型白酒固态发酵工艺显著影响稻壳水热抽提效率

为进一步考察白酒固态发酵工艺对稻壳抗生物质降解屏障的影响，本文选取高温水热抽提法来破坏原料稻壳和酒糟稻壳的抗降解屏障，以高温水热抽提法对二者组分的抽提效率差异来说明白酒固态发酵工艺对稻壳抗降解屏障的影响。由于稻壳生物质结构的特殊性，本部分研究首先以稻壳生物质组分抽提效率为指标优化了稻壳高温水热预处理的温度条件（见表2）。

表1 原料稻壳和酒糟稻壳成分

图1 稻壳和酒糟稻壳以及高温水热预处理后稻壳和酒糟稻壳的结晶度

表2 稻壳高温水热预处理条件优化(%)

由表2可知，原料稻壳的固体残留率随温度的升高而显著下降，在处理温度为200℃，处理时间为30m in的条件下，质量分数约为34.4%的稻壳被抽提出，残留稻壳质量为原料稻壳的65.6%。160℃水热抽提后，约97.9%的稻壳纤维素保留在固相内，只有2%的纤维素及其降解产物溶于抽提液。180℃时，水热抽提稻壳纤维素效果与160℃相似。升温至200℃后，稻壳纤维素的抽提效率显著上升，固相中纤维素质量只占总纤维素质量的87.9%，而液相中纤维素和损失的纤维素则分别达到了4.5%和7.6%。由表2也可看出，温度对稻壳内半纤维素抽提效率具有显著影响，例如160℃处理后稻壳半纤维素残留率可达85.9%，而一旦温度升高至180℃，其半纤维素固相残留率仅为18.4%，升温至200℃后半纤维素固相残留率进一步降低为4.7%。然而研究也发现，温度达到200℃时，半纤维素损失率高达92.5%，液相中半纤维素得率仅为2.8%。而180℃时，液相半纤维素得率可达47.5%，损失率仅为34.1%。综合考虑稻壳固相残留率、半纤维素抽提率和液相半纤维素得率，本研究选择180℃，30m in为稻壳高温水热预处理条件。

表3显示了原始稻壳和酒糟稻壳的水热抽提效率。由结果可知，原始稻壳纤维素和灰分抽提率均显著高于酒糟稻壳的抽提率（P＜0.05），而酒糟稻壳的酸不溶木质素和半纤维素抽提率显著高于原始稻壳（P＜0.05），并且离子色谱检测结果也显示，稻壳抽提液中半纤维素降解产物与酒糟稻壳抽提液中的半纤维素降解产物呈现显著不同特征（表4），如原始稻壳水热抽提液中半纤维素降解产物以聚合度大于7的木聚糖为主（含量70%），而小分子的木寡糖（聚合度2～7）和木糖含量只占30%，然而酒糟的半纤维素降解产物以低聚合度的木寡糖和木糖为主（占70%以上）。固态发酵工艺对稻壳的酸溶性木质素的抽提率并无显著影响（P＞0.05）。另外，XRD分析也发现，水热处理显著增加了稻壳纤维素的结晶度，例如原始稻壳纤维素结晶度由水热处理前的38.47%增加至44.64%，酒糟稻壳的纤维素结晶度由水热处理前的29.43%增加至42.65%，但水热处理后的原始稻壳与酒糟稻壳在纤维素结晶度方面并无显著差异（图1）。

表3 稻壳成分的高温水热抽提率

表4 高温水热处理后稻壳半纤维素降解产物聚合度分布

2.3 浓香型白酒固态发酵过程对水热抽提预处理稻壳纤维素酶解效率的影响

如图2所示，酒糟稻壳纤维素酶解率与原始稻壳并无显著区别，但经水热预处理后酒糟稻壳的纤维素酶解率则显著高于水热处理的原始稻壳，这表明经固态发酵体系处理的稻壳再经水热抽提后，其酶解效果显著优于仅水热预处理的原始稻壳。同时这个结果也说明固态发酵与水热预处理之间存在着显著的协同效应。

3 讨论

图2 稻壳纤维素的酶解率

图3 白酒固态发酵生物质降解体系的组成

浓香型白酒固态发酵体系中的酒醅微生物区系与酒窖内周围微生态环境相互作用后形成了特殊的生物质降解体系（图3）。在此体系内多种不同功能的微生物群落在生物质降解的不同阶段，在合适的氧气浓度、温度、水活度和pH值条件下，利用无机营养物质和有机碳源生长繁殖，并分泌降解特定生物质成分的酶（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及纤维素酶、半纤维素酶等）及小分子物质（有机酸和过氧化物）作用于发酵原料，将淀粉、蛋白质、脂肪等大分子聚合物降解为自身可利用的营养物质,从而在生成醇、酸和酯等物质并形成各种具有独特风味白酒的同时，也完成了对发酵原料的降解[6-8]。因此笔者认为，中国传统的白酒固态发酵过程实际上就是一个既能同时生产高附加值目的产物（白酒）又具有高效木质纤维素预处理能力的长期生物加工过程。其木质纤维素预处理作用潜力主要表现在以下几个方面：

（1）类物理预处理作用。稻壳作为发酵辅料，要经过高温清蒸30～40m in，与粮食和母糟混合后又要在蒸酒、熟化淀粉环节高温处理多次，原始稻壳经过整个发酵过程热处理时间累计可达数小时（浓香型）至数十小时（酱香型）[5]。稻壳中的果胶多糖在此过程中分解并生成甲醇[12]。

（2）长时间生物预处理。拌曲后稻壳、粮粉和母糟混合物需堆积或入窖发酵，浓香型发酵工艺每一轮发酵周期约为70 d，而酱香型发酵工艺中7轮堆积和入窖发酵累计时间达8个月之多。也就是说高温预处理的稻壳要进行长达数月的白酒固态发酵生物质降解群落的生物预处理。白酒固态发酵生物质降解群落是一个由多种不同的微生物群落、降解不同生物质成分的酶系构成的复杂生境系统。白酒固态发酵体系的微生物群落见图3，包括霉菌、细菌、酵母菌和放线菌。霉菌主要包括可分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和单宁酶的曲霉(米曲霉、黑曲霉、红曲霉)、根霉(黑根霉、米根霉、中华根霉、无根根霉)、毛霉、犁头霉和青霉等可降解木质纤维素的腐生真菌[6，8]。细菌为白酒固态发酵后期的优势菌，其中芽孢杆菌和放线菌也是能够通过分泌纤维素酶来降解木质纤维素的微生物种群[8]。

（3）类化学预处理作用。微生物代谢产物及其衍生物是白酒固态发酵生物质降解群落的另一重要组成部分（图3），根据分析固态发酵体系中含有包括醇、醛、酸、酮、酯、芳香和酚类等化学物质，其中以乙醇、乳酸和乙酸含量最为丰富。如发酵酒醅中乙醇浓度可达约5%。而高浓度的乙醇和有机酸可抽提及溶解木质纤维素中半纤维素，破坏木质纤维素结构。酒醅含有的高浓度乙酸、草酸、琥珀酸等有机酸，其中草酸对木质素的降解具有重要作用[13]。

为考察浓香型白酒固态发酵体系对稻壳生物质抗降解屏障的影响，研究选取原始稻壳及经白酒固态发酵工艺预处理的酒糟阶段稻壳为研究材料，分析了发酵前后稻壳成分的变化并应用水热抽提预处理工艺（180℃，30m in，固液比4∶1）对原始稻壳和酒糟稻壳进行水热预处理。结果显示，酒糟稻壳的纤维素含量、纤维素结晶度均显著低于原料稻壳。这说明浓香型白酒固态发酵生物质降解体系具有纤维素降解能力，可利用辅料稻壳内容易降解的无定形纤维素。同时酒糟稻壳显著低于原料稻壳的纤维素水热抽提率也表明固态发酵预处理后酒糟稻壳已不含易降解的纤维素成分，而原始稻壳内依然保留易降解的纤维素组分，因此水热抽提后原始稻壳纤维素的抽提率显著高于酒糟稻壳。

虽然未见报道研究固态发酵产白酒过程中木质素的降解以及漆酶、锰过氧化物酶等木质素降解酶活性，但是发酵过程中木质素降解产物苯酚、4-乙基愈创木酚、2,4-二叔丁基苯酚等酚类物质的出现，暗示固态发酵过程中确实可能存在木质素的降解现象[14-15]。本研究的结果——显著低于原料稻壳的酒糟稻壳酸溶性木质素的含量，高温水热抽提率结果表明，白酒固态发酵生物质降解体系可降解部分酸溶性木质素。另外，对于大分子的酸溶性木质素而言，经固态发酵过程处理后其高温水热抽提效率上升了2倍之多，这表明白酒制作过程可能显著改变了稻壳木质素的结构，使之更加疏松，易于脱落并分布在水中。

稻壳半纤维素是水热预处理作用的主要成分，结果显示酒糟稻壳的半纤维素水热抽提率显著高于原始稻壳（表3），并且离子色谱检测结果表明，抽提液中半纤维素降解产物也呈现显著不同特征（表3），如原始稻壳水热抽提液中的半纤维素降解产物以聚合度＞7的木聚糖为主（含量70%），而小分子的木寡糖（聚合度2～7）和木糖含量只占30%，然而酒糟的半纤维素降解产物以低聚合度的木寡糖和木糖为主（占70%以上），以上这些结果说明白酒发酵工艺确实改变了稻壳的半纤维素的存在方式，这种改变使半纤维素易于被抽提出和降解。

稻壳最为显著的特点是高灰分（7%～9%），水稻表皮层形成角质-硅-蜡覆盖，构成入侵微生物的机械性屏障；而细胞壁的半纤维素、纤维素与相间的硅质-木质化多酚结构，则通过甲氧基的结合，阻碍了纤维多糖及其镶嵌的结构营养的生物降解利用[16-17]。虽然已有报道发现常见木质纤维素降解菌——尖孢镰刀菌具有生物除硅的作用，即将稻壳表面的无定形硅石转变为晶体硅，并与稻壳剥离，从而初步破坏稻壳表面的物理屏障[16]。而草腐生食用菌也可提高稻草硅化物溶解率与表皮组织中硅质-木质化结构的降解转化效果[17]。但是本研究发现，固态发酵后稻壳的灰分含量未见显著降低，而且发酵后稻壳灰分的水热抽提效率反而显著降低，这表明固态发酵过程可能改变了稻壳富硅机械性屏障和硅质-木质化屏障的组成结构，尤其是硅酸盐结构，使之更加稳定。但是这并没有降低水热后酒糟稻壳的纤维素酶解效率。

纤维素酶解实验最直接的反映了稻壳抗降解屏障的变化对纤维素酶解效率的影响，研究结果虽然表明单纯固态发酵过程并没有直接增加稻壳纤维素的酶解效率，但是2倍于原料稻壳的水热处理后酒糟稻壳的纤维素酶解效率却表明了固态发酵过程与高温水热预处理法之间显著的协同效应。这种协同效应则反映出白酒固态发酵过程对稻壳生物质抗降解屏障的破坏作用。

综上所述，本研究首次从稻壳成分变化和稻壳高温水热预处理效果以及纤维素酶解效率三方面说明了浓香型白酒固态发酵工艺对稻壳抗降解屏障具有破坏作用，也证明了中国传统的浓香型白酒固态发酵工艺体系实际上是一个具有木质纤维素预处理能力的生物质降解体系。它可以在发酵产生酒精及风味物质的同时完成对稻壳抗降解屏障的预处理。具体研究结论体现为以下几点：（1）浓香型白酒固态发酵过程可改变稻壳组成成分；（2）浓香型白酒固态发酵工艺显著影响稻壳水热抽提效率；（3）浓香型白酒固态发酵过程可显著增加水热抽提预处理后稻壳纤维素酶解效率；（4）中国传统的白酒固态发酵过程是一个既可生产高附加值目的产物（白酒）又具有高效木质纤维素预处理能力的长期生物加工过程。

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Effects of Solid-State Fermentation of Nongxiang Baijiu on the Recalcitrance of Rice Husk

WANG Dandan1,2,WANG Liying2,WEI Yuxi1,CUI Qiu2and SUN Zhijie2
（1.College of Life Sciences,Qingdao University,Qingdao,Shandong 266071;2.Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao,Shandong 266101,China)

The change in the compositions of rice husk before and after solid-state fermentation of Nongxiang Baijiu was investigated.Besides, the effects of solid-state fermentation on hydrothermal pretreatment and cellulase hydrolysis of rice husk were studied.The results suggested that,1.There was significant change in cellulose content,lignin and ash content and cellulose crystallinity of rice husk;2.the extraction rate of hemicellulose and acid-insoluble lignin of rice husk by hydrothermal pretreatment increased dramatically and the polymerization degree of hemicellulose degradation products decreased significantly;3.enzymatic hydrolysis efficiency of hydrothermal pretreated rice husk increased by more than two times.The above findings proved that solid-state fermentation has both the powerful lignocellulose pretreatment capability and the production capacity of high value-added liquor products.

solid-state fermentation of Nongxiang Baijiu;rice husk;recalcitrance

TS262.3；TS261.4；TS261.2

A

1001-9286（2017）01-0025-05

10.13746/j.njkj.2016324

吉林省公主岭市科技开发项目（Y 56206190G）和国家自然科学基金项目（No.31570029）。

2016-11-02

王丹丹（1990-），女，山东省青岛市人，微生物学专业硕士研究生，研究方向为微生物资源的开发与利用，E-mail：wddsarah1314@163.com。

孙志杰（1978-），博士，副研究员,主要从事农产废弃物的综合利用技术开发，E-mail：sunzj@qibebt.ac.cn。