心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

袁秋贞，郑 旭，刘 富，程晓毅，考玉萍

1. 陕西省中医医院药剂科(西安 710003)，2. 陕西省食品药品检验所药理室(西安710000)，3. 西安市碑林区柏树林社区卫生服务中心(西安710000)，4. 西安市长安区医院(西安710000)



心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

袁秋贞1，郑 旭2，刘 富3，程晓毅4，考玉萍1

1. 陕西省中医医院药剂科(西安 710003)，2. 陕西省食品药品检验所药理室(西安710000)，3. 西安市碑林区柏树林社区卫生服务中心(西安710000)，4. 西安市长安区医院(西安710000)

目的：观测心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及可能机制。方法：H9c2细胞随机分为对照组、模型组、心肌片低中高剂量组，预给药24h后，建立心肌缺血/再灌注损伤( MI/RI) 模型。检测细胞存活率，LDH释放水平，蛋白印迹法检测心肌细胞凋亡相关基因 Bax，Bcl-2，Caspase-3，Cyt-C蛋白的表达以及AMPK磷酸化水平。结果：与模型组比较，心肌片提高细胞存活率，减少LDH水平，稳定线粒体膜电位，减少Bax，Caspase-3以及Cyt-C蛋白的表达，增加 Bcl-2 蛋白的表达，提高 Bcl-2/Bax 的比值(P<0.05)。进一步研究发现，这些保护作用被AMPK抑制剂Compound C取消。结论：心肌片能减轻心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能通过激活AMPK信号通路实现的。

心肌缺血/再灌注损伤 (Myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是目前几种常用血管再通手术及预后所面临的主要难题之一，其在急性心肌梗死再灌注治疗的病理生理过程中起着重要的作用[1]，研究开发有效防治再灌注损伤的药物已成为医学研究的热点之一。近年来研究发现细胞凋亡普遍存在于MI/RI过程中，并起主导地位[2]，因此在再灌注前或再灌注期间药物干预细胞凋亡，能够对MI/RI到达一定的保护作用。心肌片是陕西中医医院研制的中药复方制剂，于2001年获得了陕西省食品药品监督管理局的批准文号，由党参、薤白、红花、淫羊藿、丹参等中药煎制而成，治疗心肌缺血等疾病有很好的疗效，但其作用机制不清，不利于更广泛的应用于患者。本实验研究将心肌片预给予心肌细胞，观察其对体外实验性MI/RI的作用，并初步探讨其作用机制。

材料与方法

1 药物与试剂 心肌片由陕西中医医院提供；肌钙蛋白T(cTnT)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒由南京建成生物科技有限公司生产提供；Bax，Bcl-2，Caspase-3 和β-actin抗体由Santa Cruz Biotechnology公司提供；AMPK抗体由Cell Signaling Technology (CST)提供；Western Blot相关试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL 化学发光试剂盒购自Roche，其他试剂由Sigma公司提供。

2 细胞培养及造模 H9c2大鼠心肌细胞株，购自美国 ATCC 公司(Manassas, VA, USA)，采用含 10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的高糖Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)培养基进行培养，培养基中添加1%双抗(链霉素-青霉素)后置于37℃的CO2培养箱中进行培养。细胞融合度90%左右时进行传代培养，每隔一天换新鲜培养基。在建立缺血再灌注模型时，正常培养液更换为PBS缓冲液，在缺氧培养小室充入95% N210min后，放入37℃的恒温箱中进行缺氧4h，然后倒掉PBS缓冲液，重新加入正常培养基，放置于37℃的CO2培养箱中培养6h进行复氧。

3 MTT检测细胞存活率 收集H9c2细胞，制成细胞悬液，调整细胞悬液浓度至5×104，每孔加入l00ul，37℃的CO2培养箱中培养24h。加入不同浓度药液，每孔l00ul，设5个复孔，37℃的CO2培养箱中培养24h。每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡l0min，待结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。存活率=(A测量-A调零孔)/(A对照-A调零孔)。

4 样本收集 缺血再灌注后，收集细胞培养上清液，离心后用于测定LDH和CK-MB含量；收集细胞，经超声破碎处理、离心收集上清用于测定Caspase 3, MDA和SOD水平，测定方法和步骤按照试剂盒说明书进行。

5 流式细胞术检测心肌细胞线粒体膜电位 线粒体膜电位的检测用荧光染料罗丹明 123，根据设计处理细胞后，按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测，最后所得结果用 Cell quest 软件处理。

6 采用 Western blotting 法检测心肌细胞内AMPK和ACC 的表达 具体步骤如下：裂解缓冲液裂解提取心肌细胞蛋白，BCA 法蛋白定量后，保存于-70℃备用。向此蛋白样品中加入等体积的2×电泳样品缓冲液，加热变性，按 30μg 每泳道上样，经 10% SDS-PAGE后，电转至 PVDF 膜上。5%的脱脂奶粉封闭常温下震荡1h后，加Bcl-2，Bax，AMPK和ACC 单克隆抗体，加用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG，ECL 试剂盒显影、定影。以β-actin 作内参照物。目的条带积分光密度值和上样内参积分光密度值用Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, USA)测定后，进行比较得出相对光密度值。

7 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计学软件,数据以均数±标准差来表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用 LSD-t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌片对缺血再灌注后 H9c2 细胞增殖的作用 利用MTT实验检测心肌片对H9c2细胞增殖活性的影响。心肌片在低浓度时，对心肌细胞没有毒性作用，甚至可以促进细胞的增殖，在浓度达到120 mg/ml以上时，毒性增加，故选择20,40和80 mg/ml为作用浓度进行以后实验(图1A)。与正常组比较，缺血再灌注使H9c2 细胞存活率显著下降(P<0.01)，而心肌片可以保护H9c2 细胞，降低缺血再灌注的损伤程度，并呈浓度依赖关系(图1B)。

注： A不同浓度心肌片对正常H9c2存活率的影响；B 心肌片对缺血再灌注心肌细胞的保护作用,##P<0.01 比 CON组，**P<0.01 比 I/R组

2 心肌片减轻缺血再灌注损伤 与正常对照组相比，缺血再灌注显著升高培养基内LDH水平，促进了LDH释放，造成细胞损伤，而心肌片预处理组，LDH水平显著低于缺血再灌注组，且呈剂量依赖关系(图2A)。线粒体膜电位的变化可以反映细胞凋亡或者细胞损伤情况(图2B)，缺血再灌注使线粒体膜电位显著降低，与缺血再灌注组比较，心肌片预处理使线粒体膜电位显著升高，表明其可以稳定线粒体膜电位。

注:A 心肌片对细胞培养基上清中LDH水平的影响；B心肌片对细胞线粒体膜电位的影响,##P<0.01 比 sham组，**P<0.01 比模型组

图2 心肌片减轻缺血再灌注损伤

3 心肌片减轻缺血再灌注引起的细胞凋亡 Caspase 家族的激活与细胞凋亡密切相关。为了测试缺血再灌注是否激活 Caspase-3，我们检测了Cleaved-caspase 3表达情况。如图3A所示，与正常组比较，缺血再灌注诱导的Cleaved-caspase 3显著增加；心肌片预处理使Cleaved-caspase 3表达水平显著降低，并呈剂量依赖关系。

细胞凋亡的线粒体途径通过 Bcl-2 家族蛋白调控，具有显著调节线粒体释放 Cyt-C以及 Caspase-3等 Caspase 家族蛋白的作用。本实验中，缺血再灌注使细胞内Cyt-C水平显著升高，而心肌片剂量依赖性的降低了其水平。进一步研究发现，心肌片可以调节Bcl-2/Bax比例，稳定缺血再灌注造成的Bcl-2/Bax表达失衡，从而减轻细胞凋亡(图3B)。

注：A心肌片对缺血再灌注心肌细胞内Cleaved-caspase 3和Cyt-C水平的影响；B心肌片对缺血再灌注心肌细胞

4 心肌片对AMPK信号通路调控作用 Western Blot 结果如图4 A所示，与对照组比较，缺血再灌注组P-AMPK/AMPK水平显著降低，而心肌片预处理使P-AMPK/AMPK水平呈剂量依赖性增加，说明心肌片可以激活AMPK信号通路。心肌片可以保护心肌细胞免受缺血再灌注引起的细胞存活率下降和线粒体凋亡途径激活，而这些保护作用均被AMPK抑制剂Compound C抵消(图4B和图4C)。

注：A心肌片对缺血再灌注心肌细胞内AMPK磷酸化水平的影响；用AMPK抑制剂Compound C(1μmol/L)抑制AMPK后观察心肌片对细胞

缺血/再灌注损伤(Ischemia/reperfusion injury, I/RI) 是指细胞因缺血发生可逆性、可存活的损伤，在再灌注后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍，此概念由Hearse在1977年首次提出[3]。近年已有大量实验和临床研究发现，细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发病机制中的重要环节之一[4]。梗死灶周边区域的心肌细胞凋亡扩大了梗死面积，促进心室重构，对心肌功能产生不利影响。因此有效地抑制再灌注心肌细胞的凋亡不仅可以减缓心肌细胞坏死的发生，更可以挽救大量濒死细胞，对于不可再生的心肌细胞具有重要临床意义。

近年来研究发现中药能够有效地保护再灌注缺血心肌[5,6]，本研究所用心肌片是由陕西中医医院研制而成，用于心肌缺血，病毒性心肌炎等有很好的疗效。其成分党参、薤白、红花、淫羊藿、丹参等已有大量研究报道具有心肌保护作用[7-9]，而心肌片的药理学作用及其作用机制未见报道，影响其推广应用。本实验通过建立心肌细胞缺血再灌注模型，检测心肌细胞存活率、LDH释放量等损伤性指标，结果发现心肌片预处理可以提高细胞存活率，减少LDH释放，表明心肌片具有保护心肌缺血再灌注损伤作用。

本研究结果进一步显示，心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡也有很好的抑制作用，且能稳定缺血再灌注心肌线粒体膜电位。并发现心肌片对缺血再灌注心肌 Clevead-caspase-3 和细胞色素C活性升高有很好的抑制作用，而Clevead-caspase-3 和细胞色素C活性升高也是导致细胞凋亡的重要因素。另外还发现，心肌片能够增加 Bcl-2 蛋白、减少 Bax蛋白表达，提高 Bcl-2 /Bax 比值，体现出心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的保护作用。

我们进一步阐述了心肌片保护心肌细胞缺血/再灌注损伤，抗细胞凋亡的具体机制。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶，在全身能量平衡、血糖稳定、调节脂代谢方面起关键的调节作用，此外，研究发现AMPK抑制细胞凋亡，促进缺血后心功能恢复，减少心肌梗死面积发挥保护缺血/再灌注心脏的作用[10]。在本研究中，心肌片可以剂量依赖性的激活AMPK，并且采用AMPK特异性抑制剂Compound C抑制AMPK活性后，心肌片的心肌保护作用消失，说明心肌片通过AMPK信号通路发挥心肌细胞保护作用。

综上所述，心肌片能减轻心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡，具有心肌保护作用，尤其是心肌片高剂量组作用明显，其机制可能通过激活AMPK信号通路，从而上调Bcl-2，下调 Bax，Cyt-C及 Caspase-3 蛋白表达，升高 Bcl-2 /Bax 比值有关。

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(收稿：2016-08-16)

心肌缺血/中医药疗法 @心肌片 动物，实验 大鼠

R542.2

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10.3969/j.issn.1000-7369.2017.01.062