大连蜈蚣藻孢子发育及生活史的研究

贾潇博, 姜 朋, 周汝金, 关 云, 王宏伟



大连蜈蚣藻孢子发育及生活史的研究

贾潇博, 姜 朋, 周汝金, 关 云, 王宏伟

(辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 116081)

在实验室条件下, 对大连蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao)的孢子早期发育、盘状体的形成和直立枝生长进行了详细研究, 对其生活史进行了详细观察, 并进行了温度和光照强度对孢子发育影响的研究。结果表明: (1)孢子发育类型为间接盘状体型; (2)生活史由雌、雄配子体、四分孢子体和果孢子体三相世代组成, 配子体与孢子体形态相同, 属于同型世代交替, 与属模蜈蚣藻(.)一致; (3)温度对盘状体和直立枝生长均有影响, 最适温度均为16℃; (4)光照强度对盘状体和直立枝生长均有影响, 最适光照强度分别为7 500 lx和10 000 lx。

大连蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao); 孢子发育; 生活史; 温度; 光照强度

大连蜈蚣藻(H.W.Wang et D.Zhao)隶属于红藻门(Rhodophyta)、(Gigartinales)、海膜科(Halymeniaceae)、蜈蚣藻属(C.Agardh), 是本课题组基于形态观察和L基因序列分析发现并报道的产自辽宁省大连市的一个新种。藻体紫红色, 直立, 高15~30 cm, 质软, 单生或丛生, 基部具有盘状固着器。主枝扁压状, 1~2回羽状分枝, 小枝对生或偏生, 叶片细条状, 单条或叉状, 藻体顶端及基部均有小育枝, (图1)。藻体横切面观: 由皮层及髓部组成。皮层由4~6层细胞组成, 厚度为60~80 μm, 分为外皮层和内皮层。外皮层细胞为长椭圆形或椭圆形, 长3~4 μm, 宽1~3 μm, 2~6层背斜排列; 内皮层细胞为椭圆形或不规则形状, 长6~14 μm, 宽6~10 μm。中央髓丝错综交织, 长10~40 μm, 宽2~5 μm。生长于中、低潮带的岩石或石沼中[1]。

目前关于大连蜈蚣藻的研究只限于有关新种的描述和报道, 关于孢子、盘状体和直立枝的生长发育、生活史、有关环境因子对该藻的发育影响及经济价值等均未报道。为了补充该藻的相关信息, 作者详细研究了孢子的早期发育、盘状体的形成及其类型和直立枝的生长, 探讨了温度和光照强度对其生长发育的影响, 明确了生活史构成, 丰富了大连蜈蚣藻早期发育和生活史的相关资料, 为大连蜈蚣藻的种质保存、人工养殖和可持续性开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 标本采集

用于培养的大连蜈蚣藻于2012 年7月27日采集于大连市付家庄低潮带石沼中, 将带有成熟四分孢子囊的四分孢子体和带有成熟囊果的雌配子体置于盛有海水的保温箱中, 活体带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

将天然海水过滤、灭菌, 冷却后用于实验。

使用解剖针和软毛刷去除四分孢子体和雌配子体表面附着物, 再使用灭菌海水将其冲洗数次。处理后藻体分别放置于已灭菌并铺满载玻片的玻璃缸(20 cm×10 cm×10 cm)中, 倒入灭菌海水并充气进行暂养, 暂养条件为温度16℃、光照强度10 000 lx, 光周期为光(L)︰暗(D)＝12︰12。经过24h暂养, 取出载玻片于显微镜下观察, 待视野中(10×10倍)孢子附着量达到20~30个时, 将其分别放入灭菌后的D15 cm培养皿中并编码, 倒入PES培养液(每1 000 mL的培养液中加2 mg GeO2, 防止硅藻生长)至培养皿2/3体积处, 将培养皿放置于光温控制的培养箱中持续培养, 培养过程中每3天更换1次培养液。

1.2.2 实验设计

温度组试验: 温度设置为4、8、12、16、20、24、30℃共7个梯度, 光照强度设置为10 000 lx, 光周期为L︰D＝12︰12。

光照强度组试验: 光照强度设置为3 500、5 500、7 500、10 000、12 500、14 500、16 500 lx共7个梯度, 温度设置为16℃, 光照周期为L︰D=12︰12。

1.2.3 观察方法与分析

培养期间每2天一次取出载玻片观察孢子萌发情况, 当盘状体表面萌发出直立枝后, 将其转移至灭菌的培养缸(10 cm×10 cm×5 cm)中, 进行成熟培养。

用Olympus BH2数码相机(Olympus Beijing Co.Ltd., China)照相保存, 每周每组随机抽取10个盘状体测量直径一次, 盘状体相对生长速率利用公式GR(%/d)=(lnW–ln0)/×100%求得, 公式中0表示初始盘状体直径,是培养的天数(d),W表示培养天后的盘状体直径。直立枝的相对生长速率的计算与盘状体相同。

2 结果

2.1 大连蜈蚣藻孢子(果孢子)的发育

雌配子体皮层内形成囊果, 突出于藻体表面, 直径约0.3~0.4 mm(图 2a)。室温条件下, 培养约24 h, 藻体放散出微红色果孢子, 直径为10~20 μm, 附着于载玻片上(图 2b)。经过12 h, 果孢子的一端开始膨胀并形成突起, 突起逐渐伸长, 形成萌发管, 颜色较果孢子稍浅(图 2c)。萌发管伸长过程中, 细胞内容物逐渐移向萌发管一端, 当细胞内容物变空时, 萌发管与剩下的空膜之间产生隔膜, 致使萌发管顶端膨大, 形成基本细胞(图 2d)。48 h左右基本细胞开始分裂, 3~4天后分裂成不规则状盘状体, 呈紫红色(图 2e)。培养到第25天左右, 盘状体直径超过200 μm, 并逐渐停止生长(图 2f)。继续培养, 盘状体表面会隆起若干直立枝(图 2g~h)。该直立枝不断分裂生长, 长度不断增大, 培养到第60天左右, 幼苗长度可达1 mm左右(图 2i)。

a. 藻体表面囊果; b. 果孢子; c. 萌发管; d. 基本细胞形成; e. 形成盘状体; f. 盘状体的扩大; g~h. 直立枝的形成及生长; i. 幼苗

a. algae surface capsule; b. fruit spores; c. germination tube; d. basic cell formation; e. formation of the disk-like body; f. disk-like body expansion; g–h. erect branches of the formation and growth; i. seedlings

四分孢子由四分孢子体孢子囊壁溶解后放散出, 发育情况与果孢子基本一致。

2.2 大连蜈蚣藻的生活史

图3所示为大连蜈蚣藻生活史。大连蜈蚣藻配子体为雌、雄异体, 雄配子体外皮层上形成精子囊, 精子囊聚集成群, 成熟后释放精子。雌配子体内皮层细胞分化生成了辅助细胞枝生殖枝丛和果胞枝生殖枝丛, 果胞枝生殖枝丛主枝由7~10个椭圆形细胞组成, 为果胞枝, 其上带有1~4个侧枝, 每个侧枝亦由5~11个细胞组成, 末端细胞为果胞, 不分枝, 其上有一条长形受精丝, 其下为下位细胞; 辅助细胞枝生殖枝丛主枝由7~15个近圆形细胞组成, 为辅助细胞枝, 其上有2~4个分支, 末端细胞为辅助细胞, 每个分支亦由4~9个细胞组成, 辅助细胞个体大, 原生质较浓, 颜色较深[1]。游离的精子通过受精丝与果胞结合, 形成合子, 受精完成后, 果胞与下位细胞融合产生联络丝, 合子通过联络丝与辅助细胞相结合, 融入合子的辅助细胞分离出一个简单的产孢丝, 并不断成熟为果孢子囊, 同时营养丝与周围的髓丝混杂, 围绕果孢子囊形成一个丝状囊果被, 并与果孢子囊一起形成近球形的囊果(果孢子体), 直径为200~290 μm, 成熟的囊果埋藏于皮层下, 囊果中央形成一个囊果孔, 囊果散生在藻体上。果孢子通过囊果孔释放出来, 孢子发育并形成盘状体, 生长到一定阶段的盘状体会萌发出直立枝, 直立枝生长成幼苗并不断发育成成熟的四分孢子体。

四分孢子体成熟后分化出四分孢子囊, 四分孢子囊成熟后长34~56 μm, 宽12~24 μm。经减数分裂, 形成4个四分孢子, 其外形相同, 但有性别分化, 成熟后脱离母体, 其萌发与果孢子类似, 分别萌发成雌、雄配子体。

大连蜈蚣藻的生活史, 由同型的配子体、四分孢子体和果孢子体三相世代组成, 配子体和四分孢子体外形一致, 交替出现, 为典型的同型世代交替。

2.3 温度对孢子(果孢子)发育的影响

图4为不同温度下盘状体生长情况。温度为4℃时, 果孢子不萌发; 温度为8℃时盘状体生长缓慢, 第28天时的直径仅为190 μm, 相对生长速率为4.91%;温度为12℃时盘状体增长较快, 第28天时的直径达到210 μm, 相对生长速率为7.15%; 温度为16℃时, 盘状体直径增长最快, 初始盘状体直径达超过40 μm, 第28天时盘状体直径接近250 μm, 相对生长速率为7.37%; 温度升高, 盘状体又开始生长缓慢, 第28天时, 20℃下的相对生长速率为6.14%, 24℃时为3.46%; 温度为30℃时, 果孢子不萌发。方差分析表明, 温度对盘状体生长的影响差异显著(<0.05), 且最适温度为16℃。温度为12~16℃时盘状体生长较好, 影响其生长的优劣顺序为16℃>12℃>20℃> 8℃>24℃。

图5为不同温度下直立枝生长情况。温度为8℃时, 盘状体上无法萌发出直立枝; 温度为12℃时, 直立枝生长缓慢, 第58天时的长度仅为480 μm, 相对生长速率为8.88%, 温度为16℃时, 直立枝生长最快,第58天时的长度超过1 000 μm, 相对生长速率达到10.60%, 温度为20℃时, 直立枝生长较快, 第58天时相对生长速率达到10.21%; 温度为24℃时, 直立枝无法萌发出。方差分析表明, 温度对直立枝生长的影响同样差异显著(<0.05), 且最适温度为16℃。直立枝适宜生长温度为16~20℃, 温度影响其生长关系为16℃>20℃>12℃。

温度影响四分孢子发育实验中, 与果孢子相一致。

2.4 光强对孢子(果孢子)发育的影响

不同光强下的盘状体在培养初期生长差距不明显, 继续培养, 各个时间段上的生长差距逐渐加大(图6)。光强为3 500 lx时, 盘状体生长抑制明显, 发育缓慢; 光强为5 500~12 500lx时, 盘状体生长较好, 培养28天时的盘状体计算相对生长速率, 5 500 lx时为6.32%, 7500 lx时为9.72%, 10 000 lx时为7.89%, , 12 500 lx时为3.34%; 光强为14 500~16 500 lx时, 盘状体培养到后期大量死亡。单因素方差分析表明, 光强对盘状体生长的影响差异显著(<0.05), 最适光强为7 500lx。适宜光照强度为7 500~10 000 lx。

光强对直立枝生长影响见图7。光强为3500 lx时, 盘状体上无直立枝萌发; 光强为5 500lx, 直立枝生长缓慢, 相对生长速率为9.12%, 光强为7 500~ 10 000 lx时, 直立枝生长较快, 相对生长速率分别为10.91%和11.58%; 光强升到12 500 lx时, 直立枝的生长又变得缓慢, 相对生长速率仅为9.55%; 光强为14 500 lx时直立枝萌发缓慢; 光强为16 500lx时直立枝不萌发。方差分析表明, 光强对直立枝生长的影响差异显著(<0.05), 且最适光强为10 000 lx。结果表明, 适宜光强范围为7 500~10 000 lx, 影响直立枝发育顺序为10 000 lx>7 500 lx>12 500 lx>5 500 lx>14 500 lx。

光强影响四分孢子发育实验中, 与果孢子相一致。

3 讨论

孢子的发生类型、形态、大小等生物学特征是研究红藻分类的依据[2], 通过观察发现, 大连蜈蚣藻的四分孢子和果孢子发育类型一致, 孢子发育后, 基本细胞原位分裂形成盘状体或基本细胞先分裂形成丝状体后再形成盘状体, 可见大连蜈蚣藻孢子发育类型为间接盘状型, 与猪野俊平[2]研究的蜈蚣藻(.Lamouroux C.Agardh)(现为.Kawaguchi et Wang)、刘凤贤等[3]研究的蜈蚣藻(.)与繁枝蜈蚣藻()、曹翠翠等[4]研究的细弱蜈蚣藻(.)孢子发育类型一致。培养中观察到, 盘状体在密集区域发生融合现象, 融合后的盘状体边缘颜色较浅, 中央部分较深, 显微镜下观察到盘状体中央凸起。数个盘状体相互融合, 使其固着能力增强, 尤其在自然条件下, 可有效抵御水流对固着器的冲刷, 有利于幼苗生长, 此现象也常见于其他红藻[5-7]。

研究发现, 大连蜈蚣藻生活史由同型的配子体、四分孢子体和果孢子体三相世代组成, 其中配子体由四分孢子发育而成, 四分孢子体由果孢子发育而成, 果孢子体则由配子体受精后的合子发育而成, 以寄生状态生长在雌配子体里。整个生说史过程中, 配子体和四分孢子体交替出现, 为典型的同型世代交替, 与蜈蚣藻属的模式种蜈蚣藻(.)生活史类型相同[8], 也与其他蜈蚣藻生活史类型相同[9-10]。通过研究其生活史, 进一步确定了大连蜈蚣藻的分类学地位。

温度影响海藻的生长发育, 很多的研究结果都支持这一结论[11-13]。作者在实验中发现盘状体和直立枝生长的最适温度相同, 均为16℃, 这与其在大连海域春天萌发时海水温度极为接近, 但在适宜温度范围上有差异, 盘状体生长的适宜温度范围为12~16℃, 直立枝为16~20℃, 这表明适宜直立枝生长的水温范围要高于盘状体。但盘状体和直立枝在低温(8℃以下)和高温(24℃以上)情况下不发育或生长受到明显抑制, 这说明低温和高温均不利于其生长。蜈蚣藻属不同种类孢子发育的适宜温度各不相同, 如细弱蜈蚣藻(.)的盘状体和直立枝生长的最适温度为24℃[4], 舌状蜈蚣藻(.)盘状体生长最适温度为25℃[6], 蜈蚣藻(.)和带形蜈蚣藻(.)盘状体在温度高过20℃时生长较好[14]。大连蜈蚣藻的盘状体和直立枝在温度16℃时发育最好, 明显低于蜈蚣藻属其他种, 这很可能是孢子对环境适应的结果, 大连春季海面温度15℃左右, 与实验结果的最适温度相一致。

光照强度是影响海藻生长的重要环境因子[15-16]。同样, 大连蜈蚣藻盘状体和直立枝的生长也受光照强度的影响。培养中作者发现, 盘状体和直立枝最适光强不同, 盘状体生长最适光照强度为7 500 lx, 直立枝为10 000 lx, 光照强度为7 500~10 000 lx时, 盘状体和直立枝均发育较好。盘状体在高光强和低光强下生长缓慢、颜色浅淡, 部分孢子无法发育成盘状体且培养后期盘状体大量死亡, 无法萌发出直立枝; 直立枝在高光强和低光强下同样生长缓慢, 与最适光照强度下生长的直立枝大小相差明显。自然环境下大连蜈蚣藻生长于低潮带石沼中, 暴露在强光照下时间较短, 过高光强能显著抑制其生长, 而低光照同样不利于其光合作用。

蜈蚣藻属藻类种类丰富、分布广泛[8], 很多种类具有较好的医用价值[17-18]、食用价值[19]和工业用途[20], 相信大连蜈蚣藻也具有同样的价值, 所以对大连蜈蚣藻孢子、盘状体、直立枝的生长发育和生活史的研究具有重要意义。有关大连蜈蚣藻的室内育苗以及各种环境因子对其影响的研究正在进行中。

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A study of the spore development and life cycle ofH.W. Wang and D. Zhao (Halymeniaceae, Rhodophyta)

JIA Xiao-bo, JIANG Peng, ZHOU Ru-jin, GUAN Yun, WANG Hong-wei

(College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

The effects of temperature and light intensity on the growth of discoid crusts and upright thalliofwere investigated in the laboratory. We also observed in detail the development of spores, discoid crusts, and upright thalli, and the life cycle of each stage of the development process. The results showed: (1) The type of spore development was the “mediate discal type.” (2) The life cycle was the three-phase generations of the homotypic gametophyte, tetrasporophyte, and carposporophyte. The gametophyte and tetrasporophyte were morphologically identical and appeared alternately, consistent with those of. (3) The growth of discoid crusts and upright thalli was affected by temperature, and the optimum temperature was 16℃. (4) The growth of discoid crusts and upright thalli was also affected by light intensity, and the optimum light intensity was in the range of 7500 lx and 10000 lx, respectively.

; spore development; life cycle; temperature; light intensity

(本文编辑: 梁德海)

Jan. 5, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.30870161, No. 31270251, No.31570209]

Q949.29

A

1000-3096(2016)10-0025-08

10.11759/hykx20131030001

2016-01-05;

2016-05-07

国家自然科学基金项目(30870161, 31270251, 31570209)

贾潇博(1991-), 男, 辽宁省抚顺市人, 硕士研究生, 主要从事海藻生态学研究, E-mail: 609198843@qq.com; 王宏伟, 通信作者, 教授, 博士, 从事海藻分类、多样性及其分子系统学研究, E-mail: kitamiwang@163.com