miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义

陆 爽，李 艳，邓 虹，林 昕，张明谦

miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义

陆 爽，李 艳，邓 虹，林 昕，张明谦

目的 探讨miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义。方法 选取2013年2月—2014年3月在昆明医科大学附属延安医院急诊医学科及心血管内科确诊的急性冠脉综合征病人58例，其中急性心肌梗死(AMI)30例为观察组，不稳定型心绞痛(UA)28例为对照组。同时选取健康体检者10名作为正常组。发病后不同时间点位采用微小RNA提取试剂盒对各组观察对象血浆中RNA进行提取，应用RT-PCR及qRT-PCR方法对miRNA-29b表达水平进行检测，比较各组表达差异；结合各组对象血清细胞外基质(ECM)含量、增强MRI(DE-MRI)结果、心律失常发生情况等阐述其意义。结果 发病后1 d、7 d、14 d和30 d，观察组血浆中miRNA-29b表达水平显著低于对照组(P<0.05)，观察组和对照组miRNA-29b表达水平均显著低于正常组(P<0.05)；观察组和对照组相比较其心肌纤维化发生、心律失常发生均显著增高(P<0.05)。结论 miRNA-29b表达水平与急性冠脉综合征后心肌纤维化及心律失常的发生具有密切关系。

急性冠脉综合征；微小RNA；心肌纤维化；心律失常

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是在冠状动脉粥样硬化的基础上，危险因子等多因素作用下出现粥样斑块破裂出血，最终导致血栓形成并堵塞管腔，表现以胸痛、休克为临床特征的一组临床综合征，通常分为急性心肌梗死(AMI)和不稳定型心绞痛(UA)两种类型[1]。急性冠脉综合征发生后易发生心律失常及心功能急剧恶化。据统计，目前尽管冠心病二级预防药物已广泛应用于临床，但每年依然有4%～5%的急性冠脉综合征病人因发生心律失常或者心功能恶化而死亡[2]。近年来研究发现心律失常和心功能进行性恶化与心肌纤维化形成有着密切关系，其中miRNAs在心肌纤维化形成过程中起着重要的调节作用[3]。本研究针对不同类型的急性冠脉综合征病人miRNA-29b表达水平进行检测、结合心肌纤维化血清标准物(血清细胞外基质)含量测定、增强MRI(DE-MRI)结果、心律失常发生情况等临床资料评价其意义，为改善急性冠脉综合征的预后提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年2月—2014年3月在昆明医科大学附属延安医院急诊医学科及心血管内科确诊的急性冠脉综合征病人58例，男性38例，女20例，年龄(58.1±6.45)岁。其中AMI 30例为观察组，UA 28例为对照组。纳入标准：所有急性冠脉综合征病人诊断参照2012年ESC ST抬高急性心肌梗死管理指南和2012年中华医学会非ST抬高急性冠脉综合征诊断与治疗指南诊断标准纳入，观察组及对照组均按照指南推荐给予治疗。所有入选个体参与试验均符合伦理学规定。病例排除标准：有近期手术、创伤、肿瘤、急性感染、先天性心脏病、心肌病、严重肝肾功能不全、类风湿性关节炎，脑血管意外等疾病[2]。选取健康体检者10名为正常组，男性5名，女性5名，年龄(59.3±5.62)岁。正常组来自昆明市延安医院健康体检者，满足临床资料及影像学检查无器质性病变，且血糖、血脂正常。

1.2 主要试剂 microRNA快速提取试剂盒(购自北京博凌科为生物科技公司，编号110501)；逆转录聚合酶链反应试剂盒采用Promega反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒采用Takara BIO株式会社荧光定量试剂盒(购自上海拜力生物科技有限公司)；Ⅰ型、Ⅲ型前胶原放免试剂盒和层粘蛋白(LN)和透明质酸(HA)放免试剂盒(均购自上海信裕生物科技有限公司)

1.3 试验方法

1.3.1 miRNA-29b表达检测 观察组和对照组研究对象分别在确诊ACS后1 d、7 d、14 d和30 d，应用全血(液体样本)microRNA快速提取试剂盒抽取外周静脉血标本(10～20) mL，根据产品说明书步骤，进行全血微小RNA提取。提取完毕后用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.51)TBE电泳缓冲液；150 V，15 min)进行RNA完整性检测。用OD260/OD280比值检测纯度检测。检测完毕后应用逆转录PCR试剂盒进行逆转录处理，采用实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒对miRNA-29b表达水平进行定量检测。

1.3.2 血清细胞外基质(ECM)含量检测 试验组及对照组分别在发病后30 d采集晨起空腹静脉血10 mL，转速800 r/min离心15 min，静置分离血清，置于-20℃低温冰箱中放置备用。血清细胞外基质(ECM)检测包含Ⅰ型前胶原(PCⅠ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、LN、HA。各检测成分按标准步骤进行加样、4℃放置过夜后加入分离剂、3 500 r/min离心20 min弃上清后加入放射沉淀物，采用放射免疫测定法进行检测各成分浓度。

1.3.3 心肌增强MRI(DE-MRI)检测及心律失常发生情况监测 各组在不同时间点位进行心肌对比剂延迟增强MRI(DE-MRI)检测了解心肌纤维化情况，应用计算机辅助测体积法(CAVM)对纤维化范围进行测定。各组应用24 h动态心电图对心律失常发生情况进行监测。

2 结 果

2.1 总RNA完整性测定及荧光定量PCR产物测定 琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA完整性(见图1)，检测结果28 s，18 s ，5 s条带清晰完整、无扩散现象，用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm下的吸光度，结果显示OD260/OD280在1.8～2.0，表明RNA完整并具有较好的纯度，满足实验要求。

图1 总RNA琼脂糖电泳图

2.2 各组miRNA-29b表达水平对比 观察组发病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表达水平均显著低于对照组(P<0.05)；观察组与对照组发病后1 d、7 d、14 d和30 d的血清miRNA-29b表达水平显著低于正常空白组(P<0.05)。详见表1。

2.3 各组血清细胞外基质(ECM)含量检测 应用放射免疫测定法对各组血清外基质Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、层粘蛋白和透明质酸进行测定，观察组血清ECM含量较对照组明显增高(P<0.05)。详见表2。

表1 各组不同时间点位血清miRNA-29b表达水平比较(±s)

表2 各组不同时间点位血清ECM含量比较(±s) μg/L

表3 各组不同时间心律失常发生情况比较 %

2.4 心肌增强MRI(DE-MRI)及心律失常发生情况监测 应用心肌对比剂延迟增强MRI(DE-MRI)检测了解急性冠脉综合征发生后心肌纤维化情况，观察组较对照组心肌纤维化发生率增加，急性冠脉综合征发病后心肌纤维化发生情况与病情严重程度相关，且随疾病时间延长心肌纤维化面积增大(见图2)。应用24 h动态心电图检测观察组与对照组心律失常发生情况，发现观察组心律失常发生情况较对照组明显增加，推测与心肌纤维化有关(P<0.05)。详见表3。

图2 各组不同时间点位心肌对比剂延迟增强MRI计算心肌纤维化体积图

2.5 miRNA-29b与心肌纤维化体积相关关系分析 应用Spearman相关分析对miRNA-29b表达水平与MRI(DE-MRI) 计算机辅助测体积法(CAVM)对纤维化范围进行相关关系分析(见图3)，结果相关系数r2=-0.32(P<0.05)。提示miRNA29b与心肌纤维化范围呈中度负相关关系。

图3 miRNA-29b表达量与心肌对比剂延迟增强MRI计算心肌纤维化体积相关关系散点图

3 讨 论

目前急性冠脉综合征严重威胁人类健康，发病率及死亡率逐年增高，其发病原因多为急性冠状动脉狭窄或者突然闭塞，表现为急性心肌缺血为主要特征的临床综合征，包括不稳定型心绞痛及急性心肌梗死。在急性冠脉综合征发生后心律失常和心功能恶化是导致死亡的主要原因。近年来，因持续心肌缺血导致心肌纤维化形成进而诱发心律失常和心功能恶化观点已被广泛研究[4]。而众多的证据表明多种微小RNA(如miR-29、miR-210，miR-302c，miR-185等)参与纤维化形成进程，是调节纤维化形成的关键因素之一[5-6]。因此为减少ACS发生后心肌纤维化的发生，避免心脏不良事件发生，改善临床预后，对ACS病人血清中miR-29b表达水平进行检测，并结合反应组织纤维化程度的血清细胞外基质(ECM)含量、增强MRI(DE-MRI)结果、心律失常发生情况等临床资料对其临床意义进行阐述。

本研究发现，miRNA-29b在急性冠脉综合征病人血浆中出现了表达下调。同时亦发现miRNA-29b在急性心肌梗死病人中表达下调更为明显。为明确是否持续心肌缺血后诱发心肌纤维化形成，同时验证miRNA-29b是否与心肌纤维化形成，采用无创性心肌对比剂延迟增强MRI(DE-MRI)检测验证心肌纤维化形成情况，并检测了血清反映心肌纤维化的生物学指标血清细胞外基质(ECM)含量。结果发现，随着心肌缺血严重程度加重和心肌缺血持续时间的延长，心肌纤维化发生情况明显增加，且血清细胞外基质含量明显增高，提示心肌缺血严重程度及心肌缺血的持续时间可以导致心肌纤维化的发生，通过Spearman相关分析miRNA-29b与心肌纤维化体积变化情况，发现两者呈现中度负相关，提示miRNA-29b参与了心肌纤维化的形成。分析其结果可能为持续心肌缺血导致心肌缺氧，而在低氧环境下成纤维细胞可持续性高表达胶原蛋白，产生大量胶原蛋白，其中主要成分包括Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，同时，低氧环境下可诱导产生TGF-1分泌增加，而TGF-1可通过激活TGF-/Samd信号通路促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白沉积，上述变化导致心肌纤维化形成及瘢痕增生[7-8]。而miRNA-29b对于TGF-1有明显抑制作用[9]，当miRNA-29b低表达时，可以导致其对TGF-1分泌调节失调，从而引起成纤维细胞胶原代谢紊乱，最终导致心肌纤维化形成。研究发现，随急性冠脉综合征病人发病后心律失常发生随心肌纤维化的形成增加，分析其原因是由于心律失常发生与心脏结构重构和电重构密切相关，而心肌纤维化的发生改变了心脏电传导和兴奋，导致心脏兴奋性传导不一致[10]，同时心肌纤维化形成区域异位起搏点兴奋性增加，上述原因均导致心律失常发生。

miRNA-29b在急性冠脉综合征病人血清中表达下调，且与心肌纤维化发生密切相关，诱导心律失常发生。今后有必要进一步研究miRNA-29b的表达情况及其调控机制，对减少急性冠脉综合征病人心肌纤维化的形成，改善其预后提供实验室资料。

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(本文编辑王雅洁)

昆明医科大学附属延安医院(昆明 650051)

张明谦，E-mail：gg7944@sina.com

R541.4 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.027

1672-1349(2016)24-2932-04

2016-01-15)

引用信息：陆爽，李艳，邓虹，等.miRNA-29b在急性冠脉综合征病人中的表达水平及意义[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(21)：2932-2935.