热休克蛋白60联合银杏叶提取物对动脉粥样硬化大鼠血中调节性T细胞含量及主动脉根部巨噬细胞CD36表达的影响

段虎斌，郝春艳，刘翠明，刘学军

热休克蛋白60联合银杏叶提取物对动脉粥样硬化大鼠血中调节性T细胞含量及主动脉根部巨噬细胞CD36表达的影响

段虎斌，郝春艳，刘翠明，刘学军

目的 研究联合使用热休克蛋白60(HSP60)及银杏叶提取物(GBE)对动脉粥样硬化(AS)大鼠血中调节性T细胞(Treg)含量及主动脉根部巨噬细胞CD36表达的影响。方法 取出生后30 d(1月龄)SD雄性大鼠50只，体重100 g±10 g。随机分为5组：健康对照组(C组)，AS未干预组(A组)，HSP60干预组(H组)，银杏叶提取物干预组(G组)，联合干预组(H+G组)，以上每组10只。实验采用高脂饲料造 AS 模型，于出生后150 d(即高脂饮食后120 d)各组停止高脂饮食，H组开始用HSP60灌胃，G组用GBE灌胃，H+G组用HSP60及GBE灌胃；于大鼠 180 日龄时采血并取大鼠主动脉根部后处死，通过用流式细胞技术检测各组血中Treg细胞的含量，免疫组化检测各组大鼠主动脉根部巨噬细胞CD36表达情况。结果 高脂饮食实验组主动脉内膜增厚，平滑肌细胞增生，排列紊乱，泡沫细胞浸润，肌纤维断裂；各组血清总胆固醇(TC)在180 d时较30 d时有明显升高，依次为A组、H组、G组、H+G组、C组；A组和H组之间差别无统计学意义(P>0.05)，但较G组、H+G组、C组升高均明显(P<0.05)，H+G组和G组二者之间差别无统计学意义(P>0.05)，但较C组为高，较A组和H组为低(P<0.05)；C组、A组、H组、G组、H+G组各组血中Treg细胞含量分别为(2.53±0.30)%，(1.64±0.29)%，(3.39±0.31)%，(1.70±0.25)%，(3.58±0.35)%，各组主动脉根部巨噬细胞CD36表达情况为：7.03±1.41，20.95±2.19，13.51±1.10，14.98±1.61，10.68±1.03。结论 口服热休克蛋白可以诱导免疫耐受，减轻内膜炎症，稳定斑块，阻止内膜增厚，银杏叶提取物活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂，减少脂质斑块的形成，减轻内膜炎症和内膜增厚，二者联合使用可以通过诱导免疫耐受和降脂，进一步减少内膜炎症反应，最终达到增强改善AS病变程度的效果。

动脉粥样硬化；热休克蛋白60；银杏叶提取物；调节性T细胞；巨噬细胞CD36

动脉粥样硬化(AS)可以造成血管狭窄或阻塞导致组织器官缺血缺氧或坏死，是严重危害健康的“杀手”[1]。治疗AS的药物有多种，主要包括西药(如阿托伐他汀类药物等)和中药(如银杏叶提取物等)。多位学者提出通过调节自身免疫可改善血管内膜炎症达到治疗AS的目的[2-3]。本研究探讨联合使用热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)及银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)，中西医结合治疗AS的机制。

1 材料与方法

1．1 试剂仪器 GBE(每支17．5 mg/mL，含24%银杏黄酮苷，3．1%银杏内酯，2．9%白果内酯，德国威玛舒培博士药厂生产)，HSP60 抗原(中国 北京博奥生生物技术公司)猪胆固醇每瓶25 g/瓶(中国 天津大茂化学试剂厂)，猪胆盐每瓶10 g(中国 上海江莱生物科技有限公司)，丙基硫氧嘧啶每瓶100 g(中国 苏州东瑞制药有限公司)，猪油(自购)，基础饲料(山西医科大学实验动物中心提供)维生素D3粉剂(饲料级)50万U/g(浙江花园生物高科股份有限公司)，注射维生素D3针剂1 mL：7.5 mg，30万单位(中国 江苏吴中实业股份有限公司苏州第六制药厂)，CD4FITC、CD25 APC、FOXP3 PE(美国 BDFarmige公司)；PV-6001二步法免疫组化试剂盒(中国 北京中杉金桥生物技术公司)；全自动多功能生化分析仪(日本罗氏Hitach公司)，MIAS-2000图像分析系统(中国 四川川大智胜软件股份有限公司)，流式细胞仪(型号：FACS Calibur.美国Becton-Dickinson，B-D公司)。

1．2 动物分组与给药方案 取出生后30 d(1月龄)SD雄性大鼠50只(山西医科大学实验动物中心提供)，体重100 g±10 g。随机分为5组：健康对照组(C组)，AS未干预组(AS组)，HSP60干预组(H组)，银杏叶提取物干预组(G组)，联合干预组(H+G组)，以上每组10只。 C组喂饲普通饲料，AS组、H组、G组、H+G组喂饲高脂饲料(2%胆固醇，0.2%猪胆盐，0.2%丙基硫氧嘧啶，10%猪油，87.6%基础饲料)和维生素D3粉剂(1.25×106U/kg饲料)120 d，建立AS大鼠模型，实验开始时于右下肢肌内注射维生素D3针剂(3×105U/kg体重)，每隔30 d一次，动物自由饮水；于出生后150 d(即高脂饮食后120 d)各组停止高脂饮食，H组开始用HSP60(HSP60 10 μg溶于500 μLPBS液)灌胃，G组开始用GBE溶液400 μL(含GBE0．7 mg)和100 μLPBS液灌胃，H+G组用HSP60溶液(10 μg溶于100 μLPBS液)及GBE溶液400 μL共500 μL灌胃， C组、AS组仍以500 μLPBS液灌胃，每日一次，5个组均灌胃30 d，期间均采用普通饲料喂养；于出生后180 d统一眼眶动脉和静脉采血后处死，取大鼠主动脉根部标本。流式细胞技术检测血中 CD4+CD25+Foxp3+调节性 T 细胞(Treg)含量。免疫组织化学(IHC)检测主动脉根部CD36表达情况。

1.3 制作标本 石蜡切片后采用图像分析系统照相分析，观察各组大鼠主动脉病理改变，计算血管内膜(IT )与血管内径(ID )之比( IT / ID )。

1.4 免疫组化检测 采用PV-6001二步法免疫组织化学检测试剂盒(北京中山金桥生物技术公司)。用0．01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH6．0)，高压热修复；过氧化氢孵育；加兔抗大鼠CD36(北京博奥生生物技术公司)4℃过夜。使用效价为1∶200。次日加辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG抗体一HRP多聚体，37℃孵育30 min：二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下控制显色时间。采用MIAS—2000型图像分析系统拍照，检测每个高倍视野(40×10)的目标平均灰度(Co)、视场平均灰度(Gv)和面积密度(AAR)，计算阳性单位(PU)，即Pu=[|Go—Gv|×100]/[(1-AAR)×Gmax]，其中Gmax为最大灰度(255)。

1.5 血脂检测 采用酶比色法(GPO-PAP)，严格按照试剂盒说明方法操作，取血清标本10 μL加入工作液1 mL，充分混匀各试剂管，37℃保温10 min，以试剂空白管较零，读取505 nm下的标准管和样品管吸光度。由公式计算其浓度。计算公式：血清总胆固醇浓度=样品管吸光度/标准管吸光度(mg/dL)

1.6 流式细胞仪( FCM )检测 流式细胞仪用前向角( Fsc )测向角( Ssc )设二维点图，用 Gate1 将淋巴细胞圈住，检测Gate1内细胞 10 000 个。获取荧光信号并分析数据，软件均使 用CELLQUEST 软件，用对数方式分别以 FL1 FL3，FL2 FL3作二维点图，检测 CD4、 CD25、 Foxp3 阳性率。

2 结 果

2.1 血脂检测结果(见表1) 各组血清总胆固醇(TC)在180 d时较30 d时有明显升高，依次为A组、H组、G组、H+G组、C组；A组和H组之间差别无统计学意义(P>0.05)，但较G组、H+G组、C组升高均明显(P<0.05)，H+G组和G组二者之间差别无统计学意义(P>0.05)，但较C组为高，较A组和H组为低(P<0.05)。

表1 各组不同时间血清总胆固醇水平比较(±s) mg/dL

2.2 苏木精-伊红染色(HE)染色结果 正常对照组大鼠主动脉光镜下见内皮细胞完整，内膜光滑，外膜、中膜和内膜分界清楚，中膜主要由呈同心排列的弹性纤维膜组成，基质内可见环形平滑肌细胞，内膜较薄，为疏松结缔组织，内含少量平滑肌细胞。高脂饮食实验组可形成AS斑块，AS组主动脉内膜增厚，平滑肌细胞增生，排列紊乱，部分血管内膜突起，淋巴细胞、炎性细胞、泡沫细胞浸润，肌纤维断裂，斑块形成斑块处可形成夹层动脉瘤，甚至斑块有破裂出血。各组主动脉血管内膜厚度与内径的比值。实验组主动脉血管内膜厚度与内径的比值较对照组均高(P<0.05)； H组、G组、H+G组较动脉粥样硬化未干预组(A组)IT/ID值为低(P<0.05)；但H组和G组之间差异无统计学意义(P>0.05)，二者较H+G组均高(P<0.05)。详见表2。

表2 主动脉血管内膜厚度与内径比值(±s) %

2.3 免疫组织化学结果 实验组较对照组CD36、NF-κB表达增高(P<0.05)，干预组(H组、G组、H+G组)较A组表达均低(P<0.05)，H组、G组较H+G组为高(P<0.05)，但H组、G组之间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组主动脉CD36和NF-κB表达情况(阳性单位，Pu值) (±s)

2.4 流式细胞仪检测各组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量 A组和G组CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T细胞比例较对照组(C组)为低(P<0.05)，但A组与G组之间差异无统计学意义(P>0.05)，H+G组和H组较C组、A组和G组为高(P<0.05)，但H+G组和H组之间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量(±s)

3 讨 论

GBE是一种作用广泛的天然药物，其有效成分主要为黄酮苷类和银杏内酯类化合物，具有保护血管内皮细胞，拮抗血小板活化因子，扩张血管，改善血液循环等多种作用；此外，GBE还可以改善血液流变学、降低血液黏度，目前临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗，如缺血性心脏病、脑损伤、血管痉挛等[4-5]。

HSP60是一种主要由受刺激以及死亡的内皮细胞分泌和释放的蛋白，在动脉内皮细胞受外界因素如应激、高血压、感染等刺激时，可引起HSP60的表达，被树突状细胞、淋巴细胞所识别，从而触发自身免疫反应[6]。Xu等[7]调查发现，越来越多的证据表明HSP60与AS密切相关。

近年来，有研究通过口服抗原和口服芳香烃受体配体诱导叉头蛋白P3(Forkhead box p3，Foxp3)诱导型调节性T细胞(induced Treg，iTregs)，可改善自身免疫性疾病和炎症性疾病动物模型的病情[8]。本研究通过口服HSP60抗原和银杏叶提取物，中西医结合干预动脉粥样硬化血管内膜炎症和增厚情况。

[1] Scherer DJ，Psaltis PJ. Future imaging of atherosclerosis： molecular imaging of coronary atherosclerosis with (18)F positron emission tomography[J].Cardiovasc Diagn Ther，2016，6(4)：354-367.

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[4] Wei JM，Wang X，Gong H，et al.Ginkgo suppresses atherosclerosis through downregulating the expression of connexin 43 in rabbits[J].Arch Med Sci，2013，9(2)：340-346.

[5] 陈维洲，张培智.银杏叶提取物的药理和临床研究进展(上)[J].中国新药与临床杂志，1999，18(5)： 315-317.

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(本文编辑王雅洁)

山西省卫计委科技攻关项目(No.201301068 )；山西省自然基金面上项目(No.201601D011119)；山西省归国留学基金项目(No.2011-096)；山西省基础研究计划(No.2010021034-4)

山西医科大学第一医院(太原 030001)

郝春艳，E-mail：haochunyan 68@126.com

R285.4

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.24.013

1672-1349(2016)24-2893-04

2016-10-10)

引用信息： 段虎斌，郝春艳，刘翠明，等.热休克蛋白60联合银杏叶提取物对动脉粥样硬化大鼠血中调节性T细胞含量及主动脉根部巨噬细胞CD36表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(24)：2893-2896.