水生动物嗜水气单胞菌新型疫苗研究进展

尹玉伟 ， 张培军 ， 夏克立 ， 康学会 ， 刘新宇 ， 李月红

(1.吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118； 2.吉林省卫生监测检测中心， 吉林长春130118；3.吉林省水产科学研究院， 吉林长春130000； 4.吉林省长春市新立城水库管理局， 吉林长春130119)

水生动物嗜水气单胞菌新型疫苗研究进展

尹玉伟1， 张培军2， 夏克立3， 康学会3， 刘新宇4， 李月红1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118； 2.吉林省卫生监测检测中心， 吉林长春130118；3.吉林省水产科学研究院， 吉林长春130000； 4.吉林省长春市新立城水库管理局， 吉林长春130119)

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)属于弧菌科、气单胞菌属，自然界中广泛分布，可引起鱼类、两栖类及爬行类动物暴发出血性败血症，并且对人类也有致病性，是一种典型的人-兽-鱼共患的致病菌。Ah是鱼类发病的主要病原，对水产养殖造成巨大的经济损失，过去对Ah的防治主要以抗生素为主，随着国内外的学者对Ah的研究逐渐深入，防治Ah的疫苗也有了很大的进展。本文将从嗜水气单胞菌的核酸疫苗、重组亚单位疫苗以及菌蜕疫苗的研究进行综述。

1 核酸疫苗

核酸疫苗近些年发展起来的新技术，是用编码免疫原或者与免疫原相关的真核生物表达质粒DNA(或RNA)，它经过一定的途径进入动物体内后，被动物宿主细胞摄取后能转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能够刺激机体产生免疫应答，从而起到免疫保护的作用[1]。

虽然鱼类核酸疫苗研究起步较晚，但是近些年也取得的很多成果。自1991年，Hansen等通过给鲤鱼注射重组的DNA后，能在肌肉中检测出相应的表达产物[2]。2013年，中国学者李盼等通过现有文献对Ah外膜蛋白momp进行PCR扩增后，转入真核表达载体，获得重组质粒，构建DNA疫苗；将表达蛋白免疫SD大鼠，重组质粒转染293细胞，用ELISA对大鼠血清进行检测，RT-PCR对转染细胞进行检测，都证明momp的表达，为下一步动物试验打下了基础[3]。与此同时，在2013年，美国学者Pridgeon通过重组一种载脂蛋白(ApoA1)，将ApoA1基因的DNA重组到质粒中，通过注射斑点叉尾鮰后，发现ApoA1能在鱼体组织中表达，在对嗜水气单胞菌具有较好的免疫保护作用，提出ApoA1能作为嗜水气单胞菌的DNA疫苗[4]。

2 重组亚单位疫苗

亚单位疫苗是通过提取病原微生物的某些成分制成的疫苗，如病毒的衣壳蛋白、包膜蛋白，细菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、类毒素、外毒素等。

近些年Ah重组亚单位疫苗取得了不小的进展，2010年，张翠娟等在对Ah的溶血素基因(hly基因)进行PCR扩增后，转入原核表达载体，转染大肠杆菌，发现获得产物能与抗体相互结合，将表达的产物做成类毒素免疫小鼠后发现具较高的保护效率[5]。之后，在2012年，Wu等通过克隆、纯化嗜水气单胞菌的膜外蛋白epr2～3，免疫ICR小鼠后得到较高的抗体滴度，在免疫没有接触过嗜水气单胞菌的鳊鱼后得到较好的免疫保护，并且与普通灭活苗对比免疫效果得到了显著的提升[6]。Maiti等通过克隆Ah的两个表面蛋白Aha1和OmpW，分别注射免疫鲤鱼后，在用Ah感染后，存活率分别提高到52%和71%[7]。Wang等通过重组提取Ah的表面膜蛋白Omp38，分离纯化后的蛋白、死疫苗和PBS同时进行免疫鲤鱼，发现IgM滴度和注射死疫苗的组没有显著差异，并且都显著高于PBS组；除此之外，SOD、溶酶体活性和头肾细胞的吞噬作用显著高于其他组；在应对Ah感染时，Omp38蛋白表现出较好的效果[8]。在2015年，Liu等用低聚糖核苷酸为引物，将Ah的基因组导入质粒，在大肠杆菌中表达后，通过提纯蛋白并用碳纳米管作为载体，浸浴免疫草鱼后，发现肠道微生物发生了相应的改变，七种免疫相关基因(IFN-I、TNF-α、CRP、IL-8、IgM、MHC I 和CD8α)在肠道，肾和脾表达显著提高，免疫后的草鱼能较好的抵抗Ah[9]。最近，2016年，Abdelhamed等在对Ah的基因进行序列分析后，筛选出四个菌毛蛋白(FimA、Fim、MrfG和FimOM)，进行蛋白质分离纯化，分别通过注射免疫斑点叉尾鮰后，在对注射Ah强毒，与对照组相比存活率分别提升59.83%、95.41%、85.72%和75.01%；此外，免疫的鱼肝脏、脾脏和头肾细菌量显著低于未免疫的鱼，因此，Fim和FimMrfG蛋白适合作为Ah的候选蛋白疫苗[10]。2016年，Fu等通过将传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的orf086蛋白基因插入到嗜水气单胞菌的ompA的基因中，获得重组质粒，并转染到大肠杆菌中，再将大肠杆菌和嗜水气单胞菌进行融合，用LB培养基进行筛选后，获得重组的嗜水气单胞菌，用甲醛将重组的嗜水气单胞菌灭活后通过注射免疫鲈鱼，发现这种菌能较好的保护ISKNV和Ah感染，并能提高干扰素调节因子7、白介素受体相关激酶、溶菌酶和IgM等免疫相关基因表达[11]。亚单位疫苗因其不含病原微生物的核酸，安全性较好，与此同时去除了一些不能产生保护性免疫的抗原，避免抗原之间的相互竞争，减少超敏反应的发生，提高了免疫效果，因而备受青睐。

3 菌蜕疫苗

细菌菌蜕不含细胞质和核酸成分，具有全部细菌表面抗原，并能作为自身佐剂的一种新型疫苗，由于其细胞膜上的抗原决定簇与活菌几乎相同，所以菌蜕疫苗能激起机体广泛地免疫反应，如黏膜免疫和细胞免疫，而菌蜕作为自身佐剂的主要成分是因为其细胞膜上含有免疫细胞能识别的特异性受体，这些具有受体能被巨噬细胞和树突状细胞识别，增加非特异性免疫的强度。

目前对于Ah菌蜕疫苗的研究主要是在国内，在2008年，储卫华等利用含有裂解基因E的质粒转化到Ah中，通过温度诱导28 ℃升逐渐至42 ℃，并且每隔15 min检测1次其溶菌动力学，并做无菌检验，扫描电镜观察大部分菌体诱导成菌蜕，16 h后经过试验和检测后，证实没有活菌的存在。用获得的菌蜕进行免疫银鲫，在第5～7周产生效价达27凝集抗体，而甲醛灭活组仅在第5周产生效价为26的凝集抗体，菌蜕组和甲醛灭活组均能对Ah的强毒产生保护作用，保护效率分别是78.95%和57.9%，这些结果都显示，菌蜕疫苗具有较好的保护作用[12]。而同一研究小组的Tu用含有嗜水气单胞菌菌蜕(AHG)、甲醛灭活苗(FKC)和磷酸盐缓冲液(PBS)的饲料对异育银鲫进行免疫后，发现AHG组的血清和肠黏液中的抗体显著高于其他两个组，而且用Ah强毒暴露后，AHG组的存活率显著高于其他两个组，显示较高的保护率[13]。在2016年，李绍戊等通过使用不同浓度的重组噬菌体E基因质粒来进行构建菌蜕疫苗，发现不同浓度的E基因质粒均能高效的诱导Ah的裂解，获得的Ah菌蜕疫苗进行免疫鲤鱼后发现能显著提高血清抗体水平，并且保护效率高于灭活疫苗[14]。

4 展望

Ah新型疫苗的研究，在近些年取得了很多成果，特别免疫保护方面都有了很大的提升。随着禁用抗生素的呼声越来越强烈，疫苗防病将在养殖中扮演越来越重要的角色。Ah作为一种致病菌，除抗生素外最好的防治方法就是疫苗免疫。Ah膜表面有较多的抗原位点，因而具有较大的制备高保护疫苗的潜力，并且随着CRISPR基因编辑技术在细菌疫苗中的应用[15]以及最近北京大学对疫苗研究的新思路[16]，制备出更高保护率的疫苗来防控Ah将很快实现。

[1] 韩一凡，鄢庆枇，高天翔，等．鱼类DNA疫苗研究进展[J]．海洋科学，2005，29(3)：64-69．

[2] E Hansen，K Fernandes，G Goldspink，etal．Strong Expression of foreign gene following direct injection into fish muscle[J]．FEBS Letters，1991，290(1-2)：73-76．

[3] 李盼，李素一，吴唯维，等．嗜水气单胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗载体的构建及分析[J]．福建农业学报，2013，28(9)：844-848．[4] Julia W Pridgeon，Phillip H Klesius．Apolipoprotein A1 in channel catfish：Transcriptional analysis，antimicrobial activity， and efficacy as plasmid DNA immunostimulant against Aeromonas hydrophila infection[J]． Fish & Shellfish Immunology，2013，35：1 129-1 137．

[5] 张翠娟，于宙亮，田莉瑛，等．嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析[J]．生物工程学报，2009，25(2)：251-256．

[6] Lei Wu，Ya-nan Jiang，Qian Tang，etal．Development of an Aeromonas hydrophila recombinant extracellular protease vaccine[J]．Microbial Pathogenesis，2012，53：183-188．

[7] Biswajit Maiti，Mahesh Shetty，Malathi Shekar，etal．Evaluation of two outer membrane proteins, Aha1 andOmpW of Aeromonas hydrophila as vaccine candidate for common carp[J]．Veterinary Immunology and Immunopathology，2012，149 ：298-301．

[8] Na Wang，Zhao Yang，Mingfa Zang，etal．Identification ofOmp38 by immunoproteomic analysis and evaluation as a potential vaccine antigen against Aeromonas hydrophila in Chinese breams[J]．Fish & Shellfish Immunology，2012， 34：74-81．

[9] Xiaozhe Fu，Qiang Lin，Lihui Liu，etal．Display of ISKNV orf086 protein on the surface of Aeromonas hydrophila and its immunogenicity in Chinese perch (Siniperca chuatsi)[J]．Fish & Shellfish Immunology，2016，56：286-293．

[10] Hossam Abdelhameda，Seong Won Nhoa，Gokul Turagab，etal．Protective efficacy of four recombinant fimbrial proteins of virulent Aeromonas hydrophila strain ML09-119 in channel catfish[J]．Veterinary Microbiology，2016，197：8-14．

[11] Lei Liu，Yu-Xin Gong，Bin Zhu，etal．Effect of a new recombinant Aeromonas hydrophila vaccine on the grass carp intestinal microbiota and correlations with immunological responses[J]．Fish & Shellfish Immunology，2015，45：175-183．

[12] 储卫华，庄禧懿，路承平．嗜水气单胞菌菌蜕的制备及其对银鲫的口服免疫[J].微生物学报，2008，48(2)：202-206．

[13] Tu F P，Chu W H，Zhuang X Y，etal．Effect of oral immunization with Aeromonas hydrophila ghost on protection against experimental fish infection[J]．Letters in Applied Microbiology，2010，50(1)：13-17．

[14] 李绍戊，王荻，刘红柏，等．嗜水气单胞菌菌蜕系统的构建及其免疫效果研究[J]．西北农林科技大学学报(自然科学版)，2016，44(4)：17-23．

[15] 余深翼，赵金荣，郑玲红，等．利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用[J]．畜牧兽医学报，2016，47(4)：762-770．

[16] Longlong Si，Huan Xu，Xueying Zhou，etal．Generation of influenza A viruses as live but replication-incompetent virus vaccines[J]．Science，2016，354：1 170-1 173.

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《中国兽医杂志》编辑部

2016-12-29

国家自然科学基金(30972191)；农业部948项目(2014Z34)；吉林省留学人员创新创业项目(201523)

尹玉伟(1992-)，男，硕士生，从事动物疾病及免疫研究，E-mail：yuweiyin92@yeah.net

李月红，E-mail：liyhong@sina.com

S943

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0529-6005(2017)07-0078-03