卢东升 侯志杰 王婷敏
(信阳师范学院,信阳,464000)
梅花内生真菌及其多样性1)
卢东升 侯志杰 王婷敏
(信阳师范学院,信阳,464000)
通过采样、组织分离、培养与鉴定,对梅花内生真菌种类、分布及多样性进行了初步研究。结果表明:梅花内生真菌具有丰富的生物多样性,共得到梅花内生真菌15种。其中产孢真菌8属12种,非产孢真菌3种。它们多数为半知菌,少数为接合菌,曲霉1(Aspergillussp.1)和青霉1(Penicilliumsp.1)是梅花内生真菌优势种。梅花内生真菌广泛分布于各种组织内,总定殖率为54.8%,在嫩枝木质部定殖率最高,达65.6%。梅花植物体外部生态环境及内部组织类型对内生真菌的种类与分布均有重要影响。
梅花;内生真菌;多样性
The species, distribution and diversity of endophytic fungi inPronusmumeplants were studied by sampling, tissue isolation, culture and identification. The endophytic fungi were rich in biological diversity, and total of 15 species of endophytic fungi were obtained. Among them, the 12 species belonging to 8 genera were sporulation fungi, and 3 species were non-sporulation fungi. The most fungi were belonging to Deuteromycete, and a few were zygomycete. TheAspergillussp.1 andPenicilliumsp.1 were dominant species of endophytic fungi fromPronusmumeplants. The endophytic fungi ofPronusmumewere widely distributed in various tissues. Their total colonization rate was 54.8%. The fungus colonization rate in xylem of the tender branch was highest of 65.6%. The ecological environment and the internal organization type ofPronusmumeplants had important effects on the species and distribution of endophytic fungi.
梅花(Pronusmume)属蔷薇科(Rosaceae)李属植物,是我国传统名花,位居十大名花之首。其色、香、姿、韵俱佳,且花期早,花期长,品种类型多样,栽培容易,受到广大人民群众喜爱。人们对梅花形态、生理、品种分类、栽培及病虫害防治等方面研究较多[1-7],但有关其内生真菌的研究未见报道。内生真菌是栖居于健康植物组织内的真菌种类,研究发现,内生真菌普遍存在于各种植物体内,对宿主植物生长发育和抗逆性均有重要影响[8-10]。因此,开展内生真菌调查研究对于植物的栽培、病虫害防治等具有重要意义。文中于2016年7—8月份,通过组织分离,培养观察与鉴定,对梅花内生真菌的种类、形态、分布及多样性进行了初步研究,旨在为梅花内生真菌的深入研究及资源利用提供依据。
1.1 标样采集
依据梅花生境的不同,在河南省信阳市设置了6个样地。梅花各样地位置及生境状况见表1。分别在各样地采集当年生健康嫩枝、老枝各10枝(长约15 cm),叶30片。材料分别装入无菌塑料袋内,编号后带回实验室待用。
1.2 内生真菌分离培养与鉴定
采集的标样当天进行内生真菌分离[11-13]。先将梅花老枝、嫩枝流水冲洗去表面杂物,然后将其切为长约3 cm的短段,分别放入250 mL无菌三角瓶中。无菌条件下,依次用75%乙醇、4%次氯酸钠、75%乙醇分别消毒2、10、1 min。各消毒剂之间用无菌水冲洗3次。之后从三角瓶中取出材料,将嫩枝及老枝横切为0.5 cm段,再纵剖为4等分,将皮部与木质部分开。叶器官流水冲洗后先整体消毒,消毒方法与枝相同,然后将叶柄、叶基、叶中、叶尖部分分离,叶柄切为0.3 cm长的段,叶片各部分切为边长0.5 cm的方块,最后分别将嫩枝和老枝皮部、木质部、叶柄、叶基、叶中、叶尖等不同组织块接入PSA平板培养基,每皿接组织6块。将接种后的平皿放入恒温箱中28 ℃培养。当组织块出现菌落后,挑取不同真菌菌落前沿菌丝进行转管纯化,再将纯化后的真菌转接入PSA平板培养基上进行纯培养,观察菌落的外部特征并观测菌丝及产孢结构、孢子等显微形态,照相记录,依据相关文献[14-18]对内生真菌进行鉴定。
1.3 内生真菌相关数据的统计分析
梅花内生真菌的定殖率、分离率、多样性指数及相似系数按文献[19]方法进行计算。聚类分析采用SPSS 19统计软件,以不同组织、不同样地内生真菌的丰度、种类组成及定殖率建立数据库,通过系统聚类,按组间联接方法计算区间平方欧氏距离,构建聚类树形图。
表1 梅花样地位置及生境
2.1 梅花内生真菌的种类组成及分布
经研究,梅花内生真菌种类丰富,分布普遍。在供试的梅花各样地、各种组织内均有内生真菌定殖。本试验共取梅花组织1 179块,经培养有646块组织得到真菌,内生真菌定殖率达54.8%。经统计,真菌在梅花老枝皮部、老枝木质部、新枝皮部、新枝木质部、叶柄、叶基、叶中、叶尖等组织的定殖率分别为42.0%、59.4%、38.4%、65.6%、63.8%、62.7%、52.3%、54.5%。由此可看出,梅花枝器官,以新枝木质部内生真菌定殖率最高,达65.6%。叶器官,以叶柄内生真菌定殖率最高,达63.8%。另外,不同样地同一类型梅花组织内生真菌的定殖率也有明显差别(表2)。因此,梅花内生真菌的分布,即与组织内环境相关,也与宿主生境有密切联系。
表2 梅花内生真菌的定殖率及多样性指数
样地多样性指数嫩枝皮部嫩枝木质部老枝皮部老枝木质部叶柄叶基叶中叶尖总体SY10.750.691.040.820.490.680.520.570.98SY20.380.530.680.500.891.300.991.151.24SY30.680.800.680.630.670.720.670.700.74SH0.610.710.780.700.680.680.640.710.76NW0.470.880.611.031.030.911.181.331.34BHY0.730.490.501.040.620.990.860.731.02
本研究共得到内生真菌722株。其中,产孢真菌652株,未产孢真菌70株,未产孢真菌占内生真菌总菌株数的9.7%。经观察和测定,依据其菌落、菌丝、产孢结构及孢子形态等特征进行鉴定,结果表明,产孢真菌有8属12种,未产孢真菌有3种。产孢真菌大多数为半知菌,少数为接合菌。在梅花内生真菌中,以曲霉1和青霉1分布最为广泛,在供试的梅花各个样地各种组织中均可分离到,而且分离率较高,分别为16.0%~41.0%和25.3%~39.1%(表3)。因此,曲霉1和青霉1是梅花优势内生真菌。另外,曲霉2和曲霉3仅分布于老枝皮部,曲霉4仅分布于嫩枝皮部,毛霉仅分布于嫩枝木质部。说明这些真菌分布具有组织专一性。
2.2 梅花内生真菌的多样性与相似性
不同梅花样地之间内生真菌群落结构有明显区别,样地SY1、SY2、SY3、SH、NW、BHY梅花内生真菌分别有8、4、3、2、10、9种。由此可看出,样地NW梅花内生真菌种类最丰富,为10种,真菌多样性指数达1.34;样地SH最少,仅2种,真菌多样性指数为0.76(表2)。不同样地梅花内生真菌的相似系数见表4,由表4可看出,梅花生境中的光照与湿度等生态条件越相似,内生真菌相似性也越大,反之亦反。如样地SH与SY3光照条件相似,SY3梅花栽培在建筑物旁草坪背阴处,SH靠近水塘,湿度均较大,两地梅花内生真菌相似系数达0.800;样地SY1与SY3梅花生境差异较大,样地SY1梅花栽培于花坛内,阳光充足,样地SY3梅花栽培于建筑物北面背阴处,两地内生真菌相似系数仅为0.333。
表3 梅花内生真菌的分离率及分布
表4 不同样地梅花内生真菌群落结构的相似系数
2.3 聚类分析
以梅花8种组织内生真菌种类组成、丰度、定殖率为参数进行聚类分析,结果,老枝和新枝皮部聚为一大类,其余组织聚为一大类。叶器官各组织中,叶尖与叶中聚为一小类,叶基与叶柄聚为一小类(图1)。此现象也说明了不同组织对梅花内生真菌的定殖与分布有显著影响。以相同的参数对不同样地内生真菌进行聚类分析,结果,样地SY3与SH聚为一类,其他样地聚为一类(图2)。与相似性分析结果接近。说明梅花外部环境对内生真菌同样有重要影响。
L1.老枝皮部;L2.老枝木质部;X1.嫩枝皮部;X2.嫩枝木质部,Y1.叶柄,Y2.叶基,Y3.叶中,Y4.叶尖。
图1 梅花8种组织内生真菌组成聚类分析
图2 不同样地梅花内生真菌组成聚类分析
梅花内生真菌大多数为半知菌,少数为接合菌,其种类丰富,分布普遍,有些真菌分布具组织专一性;曲霉1(Aspergillussp.1)和青霉1(Penicilliumsp.1)是梅花内生真菌优势真菌,此二种菌存在于各样地各种组织内,且分离率高;梅花内生真菌群落结构与分布与宿主内部组织类型和外部生态环境密切相关。
据研究,大茎点霉(Macrophomasp.)、拟茎点霉(Phomopsissp.)、刺盘孢菌(Colletotrichumsp.)等,在多种植物内生真菌群落中均有出现,且分离率较高[11-13],这些真菌也是梅花内生真菌群落结构中的重要组分,说明他们具有较强的生态适应性;有关梅花树栖真菌研究,仅见吕锐玲等[4]、王英祥等[5]、王爽等[6]对梅花病原真菌进行研究的报道。研究发现,梅花病原真菌常见有梅叶斑病菌(Ascochytapruni)、梅穿孔病菌(Cercosporacircumscissa)、梅黑斑病菌(Cladosporiumcarpophilum)、梅炭疽病菌(Colletotrichummume)、梅白粉病菌(Oidiumleucoconium)、梅褐斑病菌(Phyllostictamume)、梅膏药病菌(Septobasidiumbogoriense)、梅叶肿病菌(Taphrinamume)、梅枝枯病菌(Valsaleucostoma)、梅霉污病菌(Fumagovagans)等。这些病菌对梅花的生长发育危害严重。前人研究发现,有些植物内生真菌与病原菌有拮抗关系,在植物病害防治中具有重要作用[9-10]。梅花内生真菌是否对病原菌有抑制作用,它们与上述病原菌生态关系如何,尚待深入调查研究。
[1] 陈俊愉.中国梅花品种分类最新修正体系[J].北京林业大学学报,1999,21(2):1-6.
[2] 康素红,包满珠,陈龙清,等.梅花品种分类的花粉形态研究[J].园艺学报,1997,24(2):170-174.
[3] 刘德良,赖万年.夏季梅花品种耐热性生理生化指标研究[J].北方园艺,2012(2):57-61.
[4] 吕锐玲,付艳苹,谢甲涛,等.武汉梅花炭疽病病菌的多样性研究[J].植物科学学报,2011,29(3):377-384.
[5] 王英祥,浦卫琼.云南梅花病害鉴定研究[J].云南农业大学学报,2000,15(3):256-259.
[6] 王爽,李洁,王建伟,等.北京地区梅花病害名录及防控措施[J].黑龙江农业科学,2015(9):172-174.
[7] 袁蒲英,宋兴荣.梅花栽培繁殖技术[J].四川农业科技,2010(8):37.
[8] KUSARI S, ZIJHLKE S, SPITELLER M. An endophytic fungus fromCamptothecaacuminatathat produces camptothecen and analogues[J]. Journal of Natural products,2009,72(1):2-7.
[9] WANG L W, XU B G, WANG J Y, at al. Bioactive metabolites fromPhomaspecies, an endophytic fungus from the Chinese medicinal plantArisaemaerubescens[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93(3):1231-1239.
[10] 丁常宏,都晓伟,徐莹.药用植物内生真菌的功能研究进展[J].中医药学报,2013,41(3):168-171.
[11] 卢东升,卢帅,潘中超,等.水杉内生真菌生物多样性与生态分布[J].南京林业大学学报(自然科学版),2013,37(6):33-36.
[12] 卢东升,王明好,代兵.桂花树叶栖内生真菌种类与分布[J].信阳师范学院学报,2010,24(4):483-486.
[13] 卢东升,张伟,杜醒醒.信阳杉木内生真菌种类研究[J].信阳师范学院学报,2015,28(2):199-203,307.
[14] 齐祖同.中国真菌志:第5卷:曲霉属及其相关有性型[M].北京:科学出版社,1997.
[15] 孔华忠.中国真菌志:第35卷:青霉属及其相关有性型[M].北京:科学出版社,2007.
[16] 魏景超.中国鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.
[17] 戴芳澜.真菌的形态与分类[M].北京:科学出版社,1987.
[18] 邵力平,沈瑞祥,张素轩.真菌分类学[M].北京:中国林业出版社,1984.
[19] 孙剑秋,郭良栋,臧威.药用植物内生真菌多样性及生态分布[J].中国科学(C辑:生命科学),2008,38(5):475-484.
Endophytic Fungi and Their Diversity inPronusmume//
Lu Dongsheng, Hou Zhijie, Wang Tingmin
(Xinyang Normal University, Xinyang 464000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University,2017,45(1):86-89.
Pronusmume; Endophytic fungi; Diversity
1)大别山农业生物资源保护与利用学科群开放课题资助项目(201605)。
卢东升,男, 1962年11月生,信阳师范学院生命科学学院,教授。E-mail:luds0365@sina.com。
2016年8月17日。
S685.17;Q938.1
责任编辑:任 俐。