茵栀黄颗粒作为肝病辅助用药作用机制的网络药理学研究Δ

王 欢，谢 进，何惠芳，潘一敏，赵艳玲

(解放军第302医院药学部，北京 100039)



·本期特稿·

茵栀黄颗粒作为肝病辅助用药作用机制的网络药理学研究Δ

王 欢*，谢 进，何惠芳，潘一敏，赵艳玲#

(解放军第302医院药学部，北京 100039)

目的：通过网络药理学方法，探讨茵栀黄颗粒作为肝病辅助用药的辅助治疗机制。方法：通过TDT数据库和PharmMapper Server数据库筛选出茵栀黄颗粒的作用靶点；通过在线人类孟德尔遗传数据库筛选出肝炎的疾病作用靶点，通过蛋白质交互网络数据库综合分析茵栀黄颗粒治疗肝炎的“化学成分-靶点-疾病”交互网络，利用Cytoscapy 3.0软件分析以上交互网络中各节点的拓扑参数，得出茵栀黄颗粒抗肝炎的作用机制。结果：网络药理学分析结果表明，茵栀黄颗粒主要通过干预机体炎症反应、保护肝细胞而辅助治疗肝炎。结论：作为肝病辅助用药的茵栀黄颗粒能干预机体炎症反应、保护肝细胞，可辅助治疗肝炎，适用于肝病伴有炎症反应和肝细胞受损患者。该研究对临床肝病的辅助治疗具有指导意义。

茵栀黄颗粒； 网络药理学； 肝炎； 肝病辅助用药

茵栀黄颗粒由茵陈、栀子、黄芩、金银花等4味药物的提取物制成，目前在临床上主要用于治疗湿热内蕴，身目俱黄，胸胁胀痛，恶心呕吐、四肢倦怠乏力，身体困重，小便短赤等症候者。此外，茵栀黄颗粒对重型，急、慢性黄疸型，迁延性肝炎均有较好的治疗作用，常被临床用于肝病的辅助治疗[1]。目前，肝病仍然没有特效药物，故临床上在使用主要治疗药物的同时会选用一些药物作为辅助用药，以缓解患者的并发症和不良反应。解放军第302医院(以下简称“我院”)是主要治疗肝病等传染性疾病的专科医院，肝病辅助用药茵栀黄颗粒在我院的消耗量排序居前列。但若辅助用药选择不当，不仅达不到辅助治疗的效果，反而会增加肝病患者的用药风险。因此，指导合理使用辅助用药并达到理想的治疗效果显得尤为重要。本研究通过网络药理学方法，探讨茵栀黄颗粒治疗肝炎的作用机制和有效物质基础，进一步分析其作为肝病辅助用药的合理性及针对性，以期为临床用药提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 药物和疾病靶点的筛选

通过中草药综合数据库TDT(http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/review-result.php?herbid=3496)查找茵栀黄颗粒中4味药物的化学成分，并下载相应的MOL2分子结构；登录PharmMapper数据库(http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)，上传茵栀黄颗粒各药物的化合物分子MOL2结构，采用“反向药效团匹配方法”筛选人类相关药物靶点。通过在线人类孟德尔遗传数据库(http：//www.omim.org/)搜集肝炎相关的疾病靶点。其他人类交互蛋白靶点由交互蛋白数据库(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu)中获得。

1.2 “化合物-靶点-疾病”交互网络的构建和分析

为了证明网络药理学分析得出的茵栀黄颗粒中不同化合物的靶点与肝炎疾病靶点之间的相关性、科学性以及合理性，将化合物成分、药物作用靶点、疾病作用靶点和交互蛋白之间的交互关系通过“蛋白-蛋白”交互网络数据库进行分析。将分析出来的结果导入Cytoscape 3.0软件中进行可视化，并分析各靶点的相关参数。将点度中心性、中介中心性和接近中心性等3个拓扑参数作为筛选有效作用靶点的依据，同时将点度中心性≥2倍中位数、中介中心性和接近中心性≥1倍中位数的靶点作为本研究得到的重要靶点。

1.3 京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注释分析

将Cytoscape 3.0软件分析出来的直接作用靶点的UniProt数据库识别码导入功能注释工具DAVID中进行KEGG通路注释分析，得出交互网络中的直接作用靶点的作用相关通路。

2 结果

2.1 茵栀黄颗粒和肝炎的靶点筛选

基于以上数据库构建的方法，共筛选出茵陈中69个成分、1 459个靶点，栀子中35个成分、1 109个靶点，黄芩中20个成分、450个靶点，金银花中37个成分、1 004个靶点；肝炎相关的蛋白靶点共179个。以上获得的药物靶点被用来进一步构建“成分-靶点-疾病”网络。

2.2 网络构建和通路分析

中药复方治疗特定疾病的蛋白靶点的网络构建和分析能为深入理解特定药物的作用机制提供较为详实的信息。本研究重在分析茵栀黄颗粒治疗肝炎的治疗机制。图1中不同形状和不同颜色标记的点代表不同的成分和靶点：三角形代表茵栀黄颗粒中可能的有效活性成分，深灰色圆点代表药物的间接作用靶点，浅灰色圆点代表肝炎相关的疾病靶点，浅灰色四角形代表药物和疾病都直接作用的靶点，白色圆点代表药物和疾病靶点连接的交互蛋白。

图1 茵栀黄颗粒治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of Yinzhihuang granules in treatment of hepatitis

茵栀黄颗粒治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中共筛选出了16个直接作用靶点，见表1。通过评估网络中所有靶点的3个拓扑参数值，得出点度中心性的中位数值为2，接近中心性的中位数值为0.278，中介中心性的中位数值为0。表1的直接作用靶点中，除5色氨酸羟化酶1、转录因子1α/β、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶、肝配蛋白A受体2、α1抗胰蛋白酶外，雄激素受体、视黄酸受体β、肝细胞生长因子受体、CYP2C9、周期蛋白A2、生长因子受体结合蛋白2、表皮生长因子受体、磷脂酰肌醇3-激酶α亚基、半乳糖凝集素3、葡萄糖-6-磷酸异构酶和谷胱甘肽S转移酶M1均满足筛选条件，故认为这11个蛋白是茵栀黄颗粒治疗肝炎的重要蛋白。但网络药理学研究属于计算机模拟研究，得出的结论仍有一定的不确定性，故本研究继续查阅相关文献，发现肝细胞生长因子不仅可促进肝细胞DNA合成及肝细胞增殖，还可提高肝细胞抗肝毒性药物损伤的能力，对肝细胞的损伤具有保护作用。肝细胞受损时，肝细胞生长因子的合成与分泌增强，血液中肝细胞生长因子水平升高，故可将肝细胞生长因子作为肝损害指标之一，亦可作为判断病情及估计预后的参考指标，即肝细胞损伤越重，血清肝细胞生长因子水平越高，则预后越差[2]。提示肝细胞生长因子对肝脏抗损伤能力具有间接的保护作用。表皮生长因子和转化生长因子α通过表皮生长因子受体强烈刺激肝细胞增殖，从而起到抗肝损害作用[3]。半乳糖凝集素3参与细胞-细胞、细胞-细胞外基质黏附，以及细胞增殖和分化、细胞周期调节、免疫调节、炎症反应等。同时，半乳糖凝集素3还参与肿瘤坏死因子α诱导的外源性凋亡信号传导途径。研究结果显示，四氯化碳诱导肝损害过程中半乳糖凝集素3表达上调，提示半乳糖凝集素3可能参与急性肝损害的细胞凋亡和修复过程[4]。

2.3 KEGG通路注释分析

由KEGG通路注释分析得出茵栀黄颗粒治疗肝炎直接作用靶点的可能相关的通路共15条，分别为“Pathways in cancer”“Non-small cell lung cancer”“Colorectal cancer”“Prostate cancer”“Endometrial cancer”“Glioma”“Renal cell carcinoma”“Melanoma”“Focal adhesion”“Pancreatic cancer”“ErbB signaling pathway”“Jak-STAT signaling pathway”“Pentose phosphate pathway”“Dorso-ventral axis formation”“Chemokine signaling pathway”，见图2。其中，信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)蛋白在不同肝病和不同的肝损害模型中对炎症表现出不同的作用，如STAT1是促炎症信号，STAT3则表现出抗炎和促炎症的双重作用等，而炎症反应又是导致不同急、慢性肝病的重要原因。因此，“Jak-STAT signaling pathway”在急、慢性肝病的发展或治疗中扮演着重要的角色[5]。“Chemokine signaling pathway”在各种肝损害中表达上调，趋化因子与炎症细胞浸润的密切关系已得以证实，而在肝脏慢性炎症中，炎症因子、生长因子、氧应激及其产物等刺激因素可促进趋化因子的表达，高表达的趋化因子能激活肝星状细胞参与肝纤维化甚至肝硬化的形成[6]。同时，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylcholine 3-kinase，PI3K)信号在以上15条信号通路图中都有参与，而PI3K普遍存在于体内各类细胞中，在细胞存活和分化、生长、运动与凋亡等各种生理病理过程中起重要作用。也有研究结果表明，PI3K/蛋白激酶B通路在肝星状细胞增殖、凋亡中扮演着重要角色。

表1 茵栀黄颗粒治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点的拓扑参数分析

Tab 1 Analysis on topology parameter value of the dots of the “compound-target-disease” of Yinzhihuang granules in treatment of hepatitis

序号UniProt数据库识别码靶点蛋白接近中心性点度中心性中介中心性1P10275雄激素受体0 36965152730 131295892P10826视黄酸受体β0 31187198280 001929153P08581肝细胞生长因子受体0 29548660120 009594674P11712CYP2C90 30899705150 001552365P20248周期蛋白A20 34585225340 014983356P62993生长因子受体结合蛋白20 30373324210 026276797P00533表皮生长因子受体0 30968219220 037059078P27986磷脂酰肌醇3⁃激酶α亚基0 31887367120 018824509P17931半乳糖凝集素30 29971388120 0285317910P06744葡萄糖⁃6⁃磷酸异构酶0 30318379190 0031397711P177525色氨酸羟化酶10 2520300820 0000024612P09488谷胱甘肽S转移酶M10 2891649470 0001305913P42224信号转导及转录激活因子1⁃α/β0 2698872830 0025502914P11413葡萄糖⁃6⁃磷酸1⁃脱氢酶0 258482421015P29317肝配蛋白A受体20 2762030360 0058939816P01009α1抗胰蛋白酶0 2491082040 00238663

图2 茵栀黄颗粒治疗肝炎的直接作用靶点的通路注释分析Fig 2 Potential pathways annotation of putative targets of Yinzhihuang granules in treatment of hepatitis

3 讨论

肝病辅助用药在临床上大致分为8类，分别为维生素及辅酶类、必需磷脂类、解毒保肝类、抗炎保肝类、利胆保肝类、生物制剂、降酶药和中成药[7]。针对适应证选择正确的肝病辅助用药尤为重要。例如，慢性病毒性肝炎因病毒清除困难，肝脏受损与身体免疫功能有关，建议保肝为主要的治疗手段，选择抗炎保肝药、营养补充药及中成药最为合适，如复方甘草酸等；对于急性病毒性肝炎，保肝药需简单、安全、适量，一般使用维生素类药物，可再加1种中成药；药物性肝炎的发病机制包括药物直接损伤肝细胞、过敏反应或伴随肝内胆汁淤积，重症患者选用糖皮质激素，症状较轻患者选用抗炎保肝类和利胆保肝类药物为佳，再加用促解毒药如谷膀甘肽，以减轻药物毒性；脂肪肝因酒精摄入过多造成或细胞内脂肪堆积、不良饮食生活方式导致的，患者需低脂饮食，肝功能明显异常者可使用多烯磷脂酸胆碱或熊去氧胆酸；自身免疫性肝病患者则需使用免疫抑制剂和激素类药物[8]。

中药在治疗肝病上有其独特的优点，多表现出多成分、多靶点、多层次的特点[9-10]，注重在治疗肝病的同时也兼顾机体的整体调节，达到整体治疗的效果。但中药也存在其特有的缺点，如其有效成分不明确、作用机制不清晰，且药物种类繁多，若不能根据选择合适的肝病辅助用药，不仅不能起到理想的治疗效果，反而会加重病情。因此，探明肝病辅助用中药的有效活性成分及治疗机制以及揭示中药治疗肝病的靶点显得尤为重要。

茵栀黄颗粒是临床上常用的肝病用药[11-12]，但一直以来其对急、慢性肝病辅助治疗的作用机制仍未被较为全面地揭示。本研究重在研究茵栀黄颗粒治疗肝病的有效活性成分及作用机制，以期揭示茵栀黄颗粒在治疗肝炎时所表现出的靶向性，为临床肝病辅助用中药的选择提供科学合理的依据。研究结果显示，茵栀黄颗粒治疗肝炎直接作用靶点中的“Hepatocyte growth factor receptor”具有参与肝细胞保护的功能；表皮生长因子受体可以起到抗肝损害的作用；半乳糖凝集素3可能参与急性肝损害的细胞凋亡和修复过程。而KEGG通路注释分析结果表明，“Jak-STAT signaling pathway”在急、慢性肝病的发展或治疗中 扮演着重要的角色，具有调节机体炎症反应的作用；“Chemokine signaling pathway”在各种肝损害中与炎症细胞浸润的关系密切，对慢性肝病的发生与发展起到了关键性 的作用。

综合以上分析可知，茵栀黄颗粒治疗肝炎主要可能是通过干预机体炎症反应、抗肝细胞损伤和保护肝细胞的作用实现的。应主要针对急、慢性肝炎及由各种原因导致的肝细胞损伤，选择性应用肝病辅助用药。但本研究还仅局限于计算机研究，仍需进一步动物实验及临床试验等更客观的结果来证实。但本研究也体现了网络药理学在应用于临床疾病辅助治疗药物的研发方面所起到的创新性作用。

[1]陈辉扬，陈军，温平康.茵栀黄颗粒的药理作用与临床应用评价[J].药品评价，2005，2(2)：122-124.

[2]金哲洙.肝细胞生长因子与肝损伤关系研究进展[J].延边大学医学学报，2007，30(4)：307-309.

[3]闫晋平，贾晋斌，马学惠，等.实验性肝硬变时表皮生长因子受体在肝细胞核表达的免疫组织化学研究[J].1998，6(1)：15-16.

[4]郑华川，王威，关一夫，等.CCL4诱发galectin-3基因敲除鼠急性肝损伤的实验研究[J].中国医科大学学报，2008，37(5)：603-606.

[5]王艳，高斌.JAK-STAT信号通路及STAT蛋白在慢性肝病中的研究进展[J].临床肝胆病杂志，2012，28(11)：805-811.

[6]胡迎宾，田德安，刘南植.趋化因子与肝病的研究进展[J].世界华人消化杂志，2003，11(7)：1040-1042.

[7]贡联兵.肝胆疾病辅助治疗药物的临床合理应用[J].中国医院用药评价与分析，2013，13(2)：103-104.

[8]孙定人，彦玲，张石革.肝病的辅助用药[J].中国药房，2002，13(1)：63.

[9]王勇，李春，仇琪，等.中药复方多成分多靶点协同增效药理药效评价体系[J].中国科学，2016，46(8)：1029-1032.

[10] 陶丽，范方田，刘玉萍，等.中药及其组分配伍的整合作用研究实践与进展[J].中国药理学通报，2013，29(2)：153-156.

[11] 朱明锦，夏伟，徐之也，等.茵桅黄颗粒治疗新生儿病理性黄疸系统评价[J].辽宁中医药大学学报，2013，15(1)：125-127.

[12] 邹士辉.茵栀黄颗粒治疗药物性肝病30例疗效观察[J].中国老年保健医学，2015，13(3)：42-43.

Network Pharmacology Study of Liver Disease Adjuvant Characteristics of Yinzhihuang Granules Based on Correlation MechanismΔ

WANG Huan, XIE Jin, HE Huifang, PAN Yimin, ZHAO Yanling
(Dept.of Pharmacy, No.302 Hospital of People’s Liberation Army, Beijing 100039, China)

OBJECTIVE：To probe into the mechanism of therapeutic action of Yinzhihuang granules as liver disease adjuvant through network pharmacology. METHODS: To select the targets of Yinzhihuang granules through TDT database and PharmMapper Server database; and the targets of hepatitis through OMIM database. The targets of drug and disease were analyzed with PPI database which could obtain an interactive network of “compound-target-disease”. Topology parameter value of the dots of the “compound-target-disease” was analyzed with Cytoscapy 3.0, so as to obtain the mechanism of therapeutic action of Yinzhihuang granules. RESULTS: According to the analysis of network pharmacology, Yinzhihuang granules in treatment of hepatitis mainly though intervening the inflammatory reaction and protecting hepatocytes. CONCLUTIONS: As liver disease adjuvant, Yinzhihuang granules can be used in treatment of hepatitis though intervening the inflammatory reaction and protecting hepatocytes. It can be applied for the patients with inflammation and hepatocellular injury. This study can prove meaningful guidance for using medicines of liver disease for clinical.

Yinzhihuang granules; Network pharmacology; Hepatitis; Liver disease adjuvant

军队十二五面上课题(No.CWS11C164)；国家重大新药创制专项(No.2015ZX09J15102-004)

R96

A

1672-2124(2016)12-1585-04

2016-08-29)

*硕士。研究方向：中药新制剂、新技术、新工艺研究。E-mail：928451725@qq.com

#通信作者：主任药师，博士，研究员。研究方向：中药药理学。E-mail：zhaoyl2855@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.12.001