胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶的检测及其临床意义

张成娟，魏 冰，马 杰

(郑州大学附属肿瘤医院、河南省肿瘤医院分子病理科，河南 郑州 450008)

胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶的检测及其临床意义

张成娟，魏 冰，马 杰

(郑州大学附属肿瘤医院、河南省肿瘤医院分子病理科，河南 郑州 450008)

目的 分析异柠檬酸脱氢酶(IDH)在胶质瘤中的突变情况，探讨IDH基因突变对胶质瘤的诊断和预后意义。方法 通过Sanger DNA测序法检测胶质瘤中IDH基因突变情况，同时比较分析IDH突变在不同人群中的突变频率以及对预后的影响。结果 20例胶质瘤患者中发现IDH突变7例，均为IDH1 R132H(C.395G>A)突变，突变率为35.0%；存在IDH突变的胶质瘤患者无进展生存期和总生存期优于IDH野生型患者。结论 IDH突变对胶质瘤的辅助诊断和预后判断具有重要的临床意义。

胶质瘤；异柠檬酸脱氢酶；基因突变

1 胶质瘤的诊治现状

胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，WHO中枢神经系统肿瘤分类将胶质瘤分为WHO Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤[1]。胶质瘤约占所有颅内肿瘤的45%，在儿童恶性肿瘤中居第2位，近30 a来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2%，中老年人群尤为明显。其中在原发性恶性中枢神经系统肿瘤中，胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM,WHO Ⅳ级)的发病率最高，占46.1%，且男性多于女性,其次是弥漫性星形细胞瘤，发病率为0.53/10万。

目前，替莫唑胺同步放疗联合辅助化疗已成为新诊断GBM的标准治疗方案，但是，胶质瘤的整体治疗效果欠佳。胶质瘤呈浸润性生长，与正常脑组织界限不清，仅靠手术难以治愈，应结合放疗和化疗等综合治疗以延缓肿瘤复发，尽可能延长患者无进展生存期和总生存期，提高生活质量。但是由于血脑屏障等因素的影响，化疗药物和一般抗肿瘤的中药治疗效果也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。其中，成人高级别胶质瘤的1 a及5 a的总生存期分别为30%和13%[1]。在目前精准医疗的大背景下以及分子病理等新兴学科的推动下，如何发现有效的胶质瘤诊治分子靶点就显得尤为重要，相关分子靶点的发现将对胶质瘤的预后预测以及对化疗药物的反应性等具有重要的科学意义和临床应用价值。

2 胶质瘤中IDH基因突变的检测

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是由IDH基因编码的蛋白酶，是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族。IDH蛋白酶通过氧化脱羧作用催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，脱下的氢进一步由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)接受生成NAD(P)H+H+。人类和其他真核生物既有NADP+依赖的IDH(IDH1和IDH2)又有NAD+依赖的IDH(IDH3)[2]。本研究中胶质瘤IDH基因突变的检测我们采用肿瘤相关基因突变检测试剂盒IDH1-IDH2(上海源奇生物医药科技有限公司)。

2.1 样本处理 石蜡切片组织，去除表面3～5张，取手术大标本(2～3张)，内镜、穿刺小标本(5～10张)，厚度3～5 μm，置于1.5 mL EP管中。用二甲苯及无水乙醇进行常规脱蜡并于100 ℃金属浴中烘干，然后加入200 μL Buffer GA，20 μL Proteinase K充分混匀，置于56 ℃水浴消化过夜，依次按步骤用石蜡样本提取试剂提取肿瘤DNA(北京天根生化科技有限公司)。2.2 PCR扩增 各反应体系配制：PCR反应液9.5 μL + MIX3 12.5 μL。从阴性对照、阳性对照、样本DNA液中分别取3 μL，加入PCR预混液中，快速离心10 s，将其移至检测区。PCR反应体系为25 μL，PCR扩增条件见表1。PCR产物需经琼脂糖凝胶电泳观察，如果各反应液的PCR产物条带清晰单一(IDH1-127-132反应液的扩增片段大小在260 bp，IDH2-140反应液的扩增片段大小在274 bp，IDH2-172反应液的扩增片段大小在194 bp)，则认为该PCR产物扩增良好，可进行测序。

表1 PCR扩增条件

保温40次循环保温42℃，5min94℃，30s72℃，5min94℃，5min58℃，30s——72℃，1min—

2.3 PCR产物的酶解 对阳性标本，其PCR产物取5 μL，再加入2 μL SAP MIX，混匀。37 ℃ 60 min，80 ℃ 15 min，最后4 ℃保存。

2.4 测序PCR反应 选取阳性PCR酶解产物3 μL、测序试剂(bigdye)1 μL和测序引物2 μL。具体条件见表2。

表2 PCR反应条件

变性30次循环恒温96℃，1min96℃，10s4℃—50℃，5s——60℃，4min—

2.5 测序产物的纯化及分析 用乙醇常规纯化测序产物，ABI 3130上机测序，然后使用测序分析软件Chromas对结果进行分析。

2.6 结果 本研究共检测脑胶质瘤患者20例，发现IDH1突变7例，均为IDH1 R132H(C.395G>A)突变，突变率为35.0%。见图1～4。

3 IDH基因突变在脑胶质瘤中的临床意义

人类IDH基因突变最早发现于成人多形性胶质母细胞瘤患者中[3]，后续有研究报道IDH1的突变也可存在于前列腺癌、大肠癌、肺癌、副神经节瘤，急性髓细胞性白血病等不同类型的肿瘤中[4]。近年来，随着高通量基因测序技术的发展，脑胶质瘤分子病理学方面的研究取得了突破性进展，目前发现的IDH突变大多数位于酶催化活性中心的保守区域，且均为杂合型突变，最常见的突变位点是IDH1 R132和IDH2 R172，其中精氨酸突变为组氨酸(R132H)是IDH1最常见的类型，约占80%～90%。

2009年，Yan等[5]就发现IDH基因突变广泛存在于脑胶质瘤患者中，且IDH突变患者的预后明显优于IDH野生型患者。在2015年6月，Jeanette等[6]的研究表明在Ⅱ和Ⅲ级胶质瘤中，IDH基因突变与患者总体生存期独立相关，且IDH突变患者的总生存期明显优于IDH野生型患者，IDH和端立酶逆转录酶(telomerase reverse trarscriptase,TERT)同时突变的患者总生存期最长，同时TERT、IDH和1p19q阴性组的患者总体生存期比TERT和IDH双重突变组或三重阳性组均明显短。Yang等[7]观察了274例胶质瘤患者基因突变与预后的关系，发现根据IDH和TERT的突变状态，将胶质瘤分为4个分子病理学亚型，其预后明显不同：IDH突变/TERT突变预后最好，其次为IDH突发/TERT野生，IDH野生/TERT野生预后较差，而IDH野生/TERT突变预后最差。同时，Zhang等[8]也发现脑胶质瘤中IDH基因状态不同，患者对放、化疗的敏感性也存在差异，研究结果表明在IDH突变组中术后接受放、化疗患者的疾病无进展生存期比未接受放、化疗患者明显延长(P<0.001)，而在IDH野生型组中未发现此现象。

图1 IDH1序列(R132)

图2 IDH1突变序列(R132H)

图3 IDH2序列(R140)

图4 IDH2序列(R172)

IDH突变是胶质瘤发生过程中重要的基因突变事件，但是具体如何导致肿瘤变化尚不清楚[9-11]。目前，Flavahan等[12]研究表明，IDH突变型胶质瘤在粘连蛋白与CCCTC结合因子的结合位点表现超甲基化，处于中间的位点高度甲基化能导致不同寻常的三维染色体构象改变，由此突变的IDH干扰染色体拓扑结构，促进促癌基因表达。同时IDH蛋白能影响肿瘤代谢，产生2-羟基戊二酸依赖羟化酶，包括5-甲基胞嘧啶羟化酶的TET家族。但由于TET酶的下游受影响的基因较多，具体如何导致肿瘤的变化目前尚不清楚。

4 结语

最近10 a来，伴随人类基因图谱的绘制完成、基因突变和疾病关系认识的深化，精准医疗正向人们走来。精准医疗是在预防、诊断和治疗疾病过程中根据个体差异提供个性化医疗服务。精准医疗通过对肿瘤发生分子基础的研究对疾病风险评估、诊断分子分型和治疗方案的设计产生重大影响，以达到降低疾病风险和更有效治疗疾病，提高人类健康水平的目的。相比较传统的形态病理学，分子病理学技术能够提供更全面、更客观的依据，从而更好指导肿瘤的靶向治疗和预后评估。精准医学是医学科技发展的必然，分子病理学也必将在未来的医疗领域里扮演越来越重要的角色。IDH基因的检测将为胶质瘤的诊断、治疗和预后评估提供重要的依据，IDH突变是低级别胶质瘤和继发性胶质瘤的重要标志物，IDH突变对辅助治疗敏感性具有良好的预测作用，根据IDH、TERT突变划分的胶质瘤分子病理学分型对评估患者预后具有极其重要的意义。

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[12]Flavahan WA,Drier Y,Liau BB,et al. Insulator dysfunction and oncogene activation in IDH mutant gliomas[J].Nature,2016,529(7584):110-114.

Detection of Isocritrate Dehydrogenase and Its Clinical Significance in the Gliomas

Zhang Chengjuan,Wei Bing,Ma Jie

(DepartmentofMolecularPathology,HenanCancerHospital,Zhengzhou450008,China)

Objective To analyze the mutations of isocitrate dehydrogenase (IDH) in the gliomas,and to explore the diagnostic and prognostic significance of IDH gene mutations in gliomas.Methods DNA Sanger sequencing method was used to detect the mutation of IDH gene,and the mutation frequency of IDH gene and the effect of mutation on the prognosis in different populations were compared.Results IDH mutations were found in 7 cases with 20 cases of glioma,which were IDH1 R132H (C.395G > A) mutation,and the mutation rate was 35.0%; the progression free survival and overall survival were longer in the patients who had the IDH mutation than the patients who had the wild type of IDH gene.Conclusion IDH mutation has an important clinical significance in the diagnosis and prognosis of gliomas.

glioma; isocitrate dehydrogenase; gene mutation

国家自然科学基础青年基金资助项目(编号：81602637)；河南省医学科技攻关计划项目(编号：201303192)

张成娟(1981-)，女，博士，主治医师，主要从事肿瘤靶向治疗相关基因检测及其临床应用的研究工作。E-mail:zcj2016@126.com

马杰(1963-)，男，硕士，硕士生导师，主要从事肿瘤病理诊断及分子分型研究工作。E-mail:majie@memail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.06.001

R735.3；R730.53

A

1673-5412(2016)06-0461-04

2016-08-10)