2株棉酚分解菌对棉籽油脱毒效果的研究

海米代·吾拉木，阿依米热·毛拉木，乌斯满·依米提

(新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

油脂安全

2株棉酚分解菌对棉籽油脱毒效果的研究

海米代·吾拉木，阿依米热·毛拉木，乌斯满·依米提

(新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046)

以从棉花秸秆中分离得到的2株棉酚分解菌莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)和死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)为实验菌株，对棉酚含量高的棉籽油进行脱毒实验。结果表明：莫海威芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌对棉籽油具有一定的脱毒作用，脱毒率分别达到22.1%和22.2%。

棉酚分解菌；脱毒效果；微生物发酵；棉籽油

新疆是我国的产棉大区，棉花总产量达353.3万～360万t(2015年)，占全国棉花产量的60%[1]，每年棉花秸秆总产量为770万t(2009年)[2]，拥有十分丰富的棉花副产品资源。棉花副产品包括棉花秸秆、棉籽饼、棉籽粕、棉籽油及棉籽油泥等[3]。棉籽油是棉花加工产量高的主要副产品之一。由于棉籽油中游离棉酚含量较高，对人体健康有害。国标GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》中规定食用棉籽油中游离棉酚的含量不得超过0.02%，超过此规定的棉籽油不能食用和出售[4-5]。

芽孢杆菌(Bacillus)是种类多、分布广的一种植物病害生物防治研究中的重要非致病细菌，是土壤和植物微生态系统的优势种群，在防治植物病害方面发挥多种有益作用。

目前采用的棉酚脱毒法有物理脱毒法、化学脱毒法及微生物发酵脱毒法。其中微生物发酵脱毒法是当前最安全、脱毒效果最好、生产成本低的脱毒方法[6]。本文以添加对游离棉酚具有分解能力的棉酚分解菌来脱除棉酚，以期为棉籽油脱除棉酚提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis，B1)、死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis，B9)，从吐鲁番地区棉花秸秆中分离得到；棉籽油，来自于新疆吐鲁番市棉籽加工厂。

磷酸，丙酮，无水乙醇，氮气，甲醇，棉酚标准品(纯度>95%)。

高压灭菌锅，振荡培养箱，数显光照培养箱，电子天平，烧杯，pH精密试纸，称量纸，超净操作台，高效液相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 棉酚标准储备液的制备

准确称取0.1 g(精确到0.000 1 g)棉酚标准品，用丙酮溶解，并定容至100.00 mL。

1.2.2 棉酚中间标准溶液的制备

取1.0 mg/mL棉酚标准储备液5.0 mL于100 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。

1.2.3 棉酚标准工作液的制备

准确吸取1.00、2.00、5.00、8.00 mL棉酚中间标准溶液于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别得到5、10、25、40 μg/mL的棉酚标准工作液。

1.2.4 HPLC测定棉酚

1.2.4.1 标准曲线的绘制

分别将棉酚标准工作液注入高效液相色谱仪中，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，棉酚标准工作液质量浓度为横坐标绘制标准曲线。HPLC条件：色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)或具同等性能的色谱柱；流动相为甲醇-磷酸溶液(体积比85∶15)；流速1.0 mL/min；柱温(40±1)℃；紫外测定波长235 nm；进样体积10 μL。得到回归方程y=59.856x-23.497，R2=0.999 8。

1.2.4.2 试样制备及测定

称取油样1 g(精确至0.01 g)于离心试管中，加入5 mL无水乙醇，剧烈振摇2 min，静置分层(或冰箱过夜)，取上清液滤纸过滤，4 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，即为试样液。将试样液注入高效液相色谱仪中，按绘制标准曲线的色谱条件进行测定，记录峰面积，根据标准曲线回归方程计算待测液中游离棉酚含量。

1.2.5 菌株活化

将分离后冻存的2株棉酚分解菌各取出1 mL，分别加入到100 mL以醋酸棉酚为唯一碳源的液体培养基中，在35℃培养24 h进行第1次活化。取出第1次活化的菌株3 mL，加入到250 mL的培养基中，在35℃培养16～24 h进行第2次活化。

1.2.6 棉酚分解菌对棉籽油的脱毒

将经两次活化的棉酚分解菌菌悬液各取5 mL分别接种到50 mL棉籽油中进行脱毒实验。对照组：未接种菌悬液，35℃振荡培养3 d的棉籽油；实验组1：添加B1菌悬液，35℃振荡培养3 d的棉籽油；实验组2：添加B9菌悬液，35℃振荡培养3 d的棉籽油。

1.2.7 数据分析

应用SPSS17和Excel软件对实验数据进行分析。

2 结果与讨论

2.1 棉酚分解菌对棉籽油中游离棉酚含量的影响(见表1)

从表1可以看出，棉酚分解菌B1和B9对棉籽油中游离棉酚脱毒率分别达到21.1%和22.2%。对照组与各实验组之间差异极显著(P<0.01)，实验组1和实验组2之间差异不显著(P>0.05)。说明2株棉酚分解菌对棉籽油有一定的脱毒作用。

表1 棉酚分解菌对棉籽油中游离棉酚含量的影响

2.2 2株棉酚分解菌脱毒效果分析

近几年来，国内有关棉酚分解菌分离鉴定的报道主要集中于酵母菌和霉菌的分离鉴定，而有关芽孢杆菌对棉酚降解作用方面的研究较少[7]。杨利民等[8]发现一种死谷芽孢杆菌(SZ-4)对恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)、腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和人参核盘菌(Sclerotiniaschinseng)菌丝生长有抑制作用。司丽娜[9]研究表明，死谷芽孢杆菌对棉花枯萎病致病菌具有拮抗作用，抑菌率可达到87.4%，并证明其与有机肥共同施用不但有防病的作用，同时还可使连作棉花土壤微生物群向合理健康的方向发展。冯中红等[10]通过实验验证莫海威芽孢杆菌(ZA1)对马铃薯坏疽病具有拮抗作用。上述文献主要研究死谷芽孢杆菌和莫海威芽孢杆菌对棉花枯萎病致病菌的拮抗作用和对马铃薯坏疽病的拮抗作用，而本文研究发现这两种菌株对游离棉酚有一定的分解作用，为其在棉籽油加工中的应用提供了基础研究。

与前人研究报道的脱毒率比较，这2株棉酚分解菌对棉籽油的脱毒率不太高，可能是由于：①棉籽油中含有2%以上的棉酚及磷脂、甾醇、树脂、脂、烃类和色素，这些成分不能只用微生物发酵法来脱除，一定要经过精炼；②在棉籽油发酵过程中，随着发酵时间的延长，底物中有机物质的浓度不断下降，微生物没有足够的营养来源，微生物浓度和活力下降，因此微生物降解率较低；③可能微生物的脱毒率与选择的样品化学性质有关，不同微生物对不同底物的脱毒率也有差别。

3 结 论

棉籽加工过程中大部分的游离棉酚沉淀在棉籽油中，因此棉籽油中游离棉酚含量较高。本文以从棉花秸秆中分离筛选的莫海威芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌为实验菌株，对棉籽油进行脱毒实验，结果表明莫海威芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌对游离棉酚的脱毒率分别达到21.1%和22.2%。目前关于棉酚分解菌对棉花副产品发酵过程中的代谢机理还不清楚，需要进行进一步研究。

[1] 刘福元，邹阿玲，陈建国，等. 整粒棉籽饲喂荷斯坦牛的试验研究[J]. 中国奶牛，2015(22)：8-10.

[2] 热沙来提汗·买买提. 化学及生物处理对棉花秸秆消化性改善效果研究[D]. 乌鲁木齐：新疆农业大学，2012.

[3] 田小红. 新疆棉副产品的主要成分的提取分析研究[D]. 乌鲁木齐：新疆大学，2012.

[4] 潘江贵. 棉酚的特性及在棉籽油生产中的工艺控制[J]. 中国新技术新产品，2013(6)：23.

[5] 刘大川. 棉籽油加工及其营养[J]. 中国油脂，2012，37(11)：8-10.

[6] 杨霞. 高效棉酚降解菌株的筛选鉴定及其差异蛋白组学研究[D]. 杭州：浙江大学，2010.

[7] 张丛，李佳，袁洪水，等. 高效降解棉酚菌株的筛选鉴定及毒性试验[J]. 中国农学通报，2012，28(12)：112-117.

[8] 杨利民，孙卓，韩梅，等. 一种死谷芽孢杆菌及其应用：CN103952329[P]. 2014-07-30.

[9] 司丽娜. 微生物菌肥菌种分离，鉴定及混合发酵[D]. 济南：山东大学，2012.

[10] 冯中红，畅涛，杨成德，等. 一株抗马铃薯坏疽病莫海威芽孢杆菌(BacillusmojavensisZA1)培养条件的优化[J]. 草业学报，2016，25(2)：77-86.

Detoxification of cottonseed oil by two gossypol decomposing bacterias

HAIMIDA Gulamu，AYMIHRI Mollal，WUSIMAN Yimitil

(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The two strains ofBacillusmojavensisandBacillusvallismortisseparated from cotton straw were used to decompose the free gossypol in cottonseed oil. The results showed thatBacillusmojavensisandBacillusvallismortishad certain detoxification effects，and their detoxification rates were 22.1% and 22.2%，respectively.

gossypol decomposing bacteria；detoxification effect；microbial fermentation；cottonseed oil

2016-05-07；

2016-10-21

国家自然科学基金项目(31260014)

海米代·吾拉木(1990)，女(维吾尔族)，在读硕士，研究方向为微生物资源开发(E-mail)haimida215@163.com。

乌斯满·依米提，副教授，博士(E-mail)xafkat@sina.com。

TS201.6;Q939.9

A

1003-7969(2017)01-0074-03