固定化脂肪酶催化桐油制备生物柴油的研究

茅燕勇，李文谦，王朝宇，时 号

(淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003)

油脂化工

固定化脂肪酶催化桐油制备生物柴油的研究

茅燕勇，李文谦，王朝宇，时 号

(淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003)

对磁性Fe3O4纳米粒固定化脂肪酶催化桐油制备生物柴油进行了研究，分步探讨了硼酸盐缓冲液用量、固定化酶用量、醇油摩尔比、反应温度、固定化酶清洗与否对转酯反应的影响，以及固定化酶的操作稳定性。结果表明：将正己烷与桐油体积比定为2∶1，然后加入与桐油等摩尔的甲醇、桐油体积6%的硼酸盐缓冲液及7.5 mg/mL(以桐油体积计)固定化酶，反应5 h和12 h各加入与桐油等摩尔的甲醇(总的醇油摩尔比3∶1)，并每次添加甲醇前用丙酮清洗固定化酶，45℃、200 r/min 反应26 h后，甲酯转化率可达91.2%。该固定化脂肪酶连续催化10批次反应后，甲酯转化率仍然可达84.1%，具有一定的工业应用价值。

磁性Fe3O4纳米粒；固定化脂肪酶；桐油；生物柴油；转酯反应

生物柴油是一类可再生、能替代石化柴油的能源，其化学组成为长链脂肪酸单酯，可用酸、碱或酶催化油脂与短链醇发生转酯反应制备[1]。酶催化法较酸、碱催化法而言，具有条件温和、醇用量小、转酯率高、污染小等优势，近年来得到广泛研究。其中，固定化脂肪酶催化法既克服了游离脂肪酶催化时存在的易结块、不易回收、产品分离困难等缺点[2]，又具有较好的操作稳定性[3]，因而得到了更多的关注。

目前，世界各国多使用产量占优的油脂作为生物柴油原料，美国、欧洲、东南亚国家分别使用大豆油、菜籽油、棕榈油作为生物柴油的主原料[1,4-5]。油桐(Aleuritesfordii)是我国四大木本油料植物之一，广泛种植于我国10多个省区[6]，种植面积和桐油产量占世界总量80%以上[4]。桐油各组分平均相对分子质量894.55、平均碳数18[7]，以此制备的生物柴油能满足石化柴油平均碳数15～22的要求。研究表明，以桐油为原料制备的生物柴油符合国家生物柴油标准[8]，按一定比例添加于0#石化柴油可提升动力性能并减轻排放污染[9-10]。因此，我国若以桐油为原料发展生物柴油，可减少桐油低端产品出口量、提升桐油经济价值、促进能源经济发展。

本文对磁性Fe3O4纳米粒固定化脂肪酶催化桐油制备生物柴油的工艺条件进行研究，为实现以桐油为原料酶法制备生物柴油提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

市售四川绵阳产脱胶桐油，市售分析纯甲醇、丙酮、正己烷、硼酸、硼酸钠、2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES，Sigma)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Sigma)、碳二亚胺盐酸盐(EDCl，Sigma)，脂肪酶(来自Candidarugosa，2 U/mg，Sigma)，自制羧基化磁性Fe3O4纳米粒(Mr为2 000 Da的双末端羧基聚乙二醇PEG修饰)。

JJ-1B恒速搅拌器，HH-2水浴锅，DHZ-C恒温摇床，XPE-105天平，岛津GC-14B气相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化脂肪酶的制备

取含铁5 mg/mL羧基化磁性Fe3O4纳米粒水溶液50 mL，磁分离并用98 mL MES缓冲液分散，先后加入现配的等浓度(2.8×10-2mmol/mL)EDCl-MES和NHS-MES各1 mL，25℃、120 r/min活化25 min，磁分离纯水洗3次，硼酸盐缓冲液(pH 8.0，0.02 mol/L，下同)复溶至100 mL，然后迅速加入到含350 mg脂肪酶的100 mL硼酸盐缓冲液中，25℃、150 r/min反应1 h，磁分离收集沉淀，立即与25 mL纯水混匀后冻干备用，橄榄油乳化法[11]测表观比酶活约1.0 U/mg。

1.2.2 转酯反应

在50 mL三口圆底烧瓶中加入10 mL桐油及20 mL正己烷，同时加入一定量的甲醇后，置于水浴锅中加热至反应温度并保温，200 r/min搅拌，然后加入适量固定化脂肪酶和硼酸盐缓冲液，反应一定时间并适时取样分析。

1.2.3 脂肪酸甲酯的测定

参照文献[7]方法并调整：样品磁分离除酶，正十三烷作内标，气相色谱仪检测。气相色谱条件：Rtx-1毛细管石英柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，FID检测器，检测器温度300℃，汽化室温度290℃，高纯氮气作载气，氢气流量30 mL/min，空气流量300 mL/min，氮气流量25 mL/min；柱温为初温140℃保持1 min，然后以10℃/min升温至280℃；分流比50∶1，进样量2 μL。

甲酯转化率=已生成脂肪酸甲酯的质量/桐油全部转化成脂肪酸甲酯的质量×100%。

2 结果与讨论

2.1 硼酸盐缓冲液用量对转酯反应的影响

在烧瓶中加入0.45 mL甲醇和10 mL桐油(醇油摩尔比1∶1)及20 mL正己烷，开启搅拌，加入3.0 mg/mL(以桐油体积计，下同)固定化酶冻干粉，分别加入桐油体积0%～10%的硼酸盐缓冲液，200 r/min、45℃反应24 h，每2 h时取100 μL上清测定甲酯转化率，结果见图1。

图1 硼酸盐缓冲液用量对转酯反应的影响

由图1可知，反应体系中加入桐油体积2%～8%的硼酸盐缓冲液，对转酯反应产生促进作用，这可能与硼酸盐缓冲液提供给固定化酶所必需的适当pH及微量水分有关。添加桐油体积6%的硼酸盐缓冲液时，甲酯转化率最高可达33%左右；而加入桐油体积10%的硼酸盐缓冲液时，则对转酯反应产生抑制作用，甲酯转化率仅有17.73%。同时，不添加硼酸盐缓冲液时甲酯转化率也可达30.35%。这可能是因为固定化酶中亲水性PEG在冻干过程中保留了微量水分，从而能在反应时给予脂肪酶一定量的“必需水”以保持较高的酶活；同时，在一定的含水率范围内，该双末端羧基PEG链状分子可能通过链的收缩与伸展，使脂肪酶始终处于油水界面上而获得较高的催化效率。从获得较高的甲酯转化率方面考虑，硼酸盐缓冲液用量为桐油体积的6%为佳。

2.2 固定化酶用量对转酯反应的影响

酶反应时，在一定范围内提高酶的浓度，可增加酶与底物的接触概率，从而获得高反应速率并快速达到平衡；酶的浓度相对于底物达到饱和时，再提高酶的浓度无益于反应速率的提高。在加入桐油体积6%的硼酸盐缓冲液时，改变固定化酶用量，其他条件不变，进行转酯反应，测定甲酯转化率，结果见图2。

图2 固定化酶用量对转酯反应的影响

由图2可知，转酯反应达到平衡的快慢与加入的固定化酶量呈正相关。在固定化酶用量为3.0 mg/mL时，达到平衡约需20 h；随着固定化酶用量的增加，达到平衡所需的时间越来越短，当固定化酶用量超过7.5 mg/mL 以后，转酯反应仅需6 h即能接近平衡。因此，基于固定化酶能重复使用的特点，并考虑获取较高的反应效率，选择固定化酶用量为7.5 mg/mL。

2.3 反应温度对转酯反应的影响

在一定范围内提高温度可加速酶催化反应，但温度过高时又会加速酶的失活并增加能耗。因此，酶反应的温度应控制在合适范围内。在反应体系中加入桐油体积6%的硼酸盐缓冲液和7.5 mg/mL的固定化酶，改变反应温度，其他条件不变，反应10 h，测试不同条件下的甲酯转化率，结果见图3。

图3 反应温度对转酯反应的影响

由图3可知，反应温度为45℃或50℃时，均可在反应6 h左右接近平衡；反应温度为40℃或55℃时，需反应8～10 h才能达到平衡。另外，反应温度为55℃时，虽然在反应开始2 h内反应速率是最高的，但此后反应速率却有所降低，最终导致达到平衡的时间延长，这可能由于高温引起部分酶失活引起的。因此，选择以45℃作为后续实验的反应温度。

2.4 醇油摩尔比对转酯反应的影响

在上述研究中，以醇油摩尔比1∶1探讨了缓冲液用量、固定化酶用量、反应温度对转酯反应的影响。转酯反应制备生物柴油时，甲醇和油脂完全反应的理论摩尔比是3∶1。因此，需考虑醇油摩尔比对转酯反应的影响。

在反应体系中加入桐油体积6%的硼酸盐缓冲液和7.5 mg/mL的固定化酶，设定反应温度为45℃，改变甲醇加入量以控制不同的醇油摩尔比，其他条件不变，反应24 h，测试不同条件下的甲酯转化率，结果见图4。

图4 醇油摩尔比对转酯反应的影响

由图4可知，醇油摩尔比1.5∶1时，虽然反应8 h后获得的甲酯转化率是最高的，但这可能是因为甲醇量相对较高引起的。醇油摩尔比较高时，实际甲酯转化率低于理论值，其原因可能是：虽然亲水性载体能通过“吸水”供给脂肪酶“必需水”，但又因为“吸水”导致甲醇更易在固定化酶上富集，最终引起酶的失活。因此，酶催化桐油和甲醇转酯反应时，添加甲醇须采用分批或流加方式。本研究中，反应体积较小，因而选择分批方式加入甲醇：即0 h加入甲醇(0.45 mL)至醇油摩尔比1∶1；甲醇转化90%以上时补加甲醇(0.45 mL)至醇油摩尔比2∶1；甲醇再次转化90%以上时补加甲醇(0.45 mL)至总的醇油摩尔比3∶1。

2.5 固定化酶用丙酮清洗与否对转酯反应的影响

有研究[12]认为，转酯反应中生成的副产物甘油会粘附在固定化酶表面并影响酶的活性，而使用丙酮对固定化酶进行清洗可恢复酶的活性。在反应体系中加入20 mL正己烷和10 mL桐油，并添加桐油体积6%的硼酸盐缓冲液和7.5 mg/mL的固定化酶，按2.4中的分批方式添加甲醇，45℃、200 r/min反应26 h，每次添加甲醇前用丙酮对固定化酶进行清洗，同时以不清洗固定化酶作为对照，研究固定化酶用丙酮清洗与否对转酯反应的影响，结果见图5。

图5 固定化酶用丙酮清洗与否对转酯反应的影响

经过研究，发现固定化酶用丙酮清洗的体系，甲醇首次和再次转化达到90%的时间分别是5 h和12 h；而不清洗的体系，甲醇首次转化达到90%的时间与前者相同，但再次转化达到90%的时间则延迟到15 h；并且，两者的甲酯转化率在12 h以后差异显著。由图5可知，反应26 h后，固定化酶用丙酮清洗的体系中甲酯转化率达91.2%，远高于未清洗体系64.1%的甲酯转化率。这说明，分批添加甲醇并同时用丙酮对固定化酶进行清洗，可促进转酯反应。

2.6 多批次反应时固定化酶的反应稳定性

在以上优化的条件下使用固定化脂肪酶进行10批次反应，每次反应26 h，以甲酯转化率考察该固定化酶的反应稳定性，结果见表1。

表1 固定化脂肪酶的反应批次及对应的甲酯转化率

由表1可知，该固定化脂肪酶反应稳定性较好，反应10批次后，甲酯转化率能保持84.1%，这可能与脂肪酶被共价固定化后，构象得到加固，稳定性得到增强有关。

3 结 论

在正己烷中，使用磁性Fe3O4纳米粒固定化脂肪酶可高效催化桐油制备生物柴油。具体反应条件为：将正己烷与桐油体积比定为2∶1，然后加入与桐油等摩尔的甲醇、桐油体积6%的硼酸盐缓冲液及7.5 mg/mL(以桐油体积计)的固定化酶，反应 5 h和 12 h 各加入与桐油等摩尔的甲醇(总的醇油摩尔比3∶1)，且每次添加甲醇前用丙酮清洗固定化酶，45℃、200 r/min反应26 h后，甲酯转化率可达91.2%。该固定化脂肪酶稳定性较好，连续催化10批次转酯反应后，甲酯转化率仍可达84.1%，具有一定的工业应用价值。

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Preparation of biodiesel from tung oil catalyzed by immobilized lipase

MAO Yanyong，LI Wenqian，WANG Zhaoyu，SHI Hao

(College of Life Science and Food Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003,Jiangsu，China)

The preparation of biodiesel from tung oil catalyzed by magnetic Fe3O4nano-particles containing immobilized lipase was studied, and the effects of dosage of borate buffer，dosage of enzyme，molar ratio of methanol to oil，reaction temperature and cleaning immobilized lipase or not on transesterification were investigated, and the operational stability of the immbilized lipase was studied. The results showed that under the conditions of volume ratio of hexane to tung oil 2∶1，molar ratio of methanol to oil 1∶1 at 0，5，12 h (total molar ratio of methanol to oil 3∶1)，dosage of borate buffer 6%(based on the volume of tung oil)，dosage of enzyme 7.5 mg/mL (based on the volume of tung oil) ，cleaning immobilized lipase by acetone before adding methanol，reaction temperature 45℃，reaction time 26 h and rotational speed 200 r/min，the conversion rate of methyl ester reached 91.2%.The conversion rate of methyl ester still reached 84.1% after ten batches reactions catalyzed by the immobilized lipase, and it indicated that the immobilized lipase had a certain value of industrial applications.

magnetic Fe3O4nano-particles; immobilized lipase; tung oil; biodiesel; transesterification

2016-05-06；

2016-10-27

淮安市科技支撑计划(HAG2011005)；淮安市重点研发计划(HAG2015031)；淮阴工学院科研基金(491712034)

茅燕勇(1977)，男，讲师，硕士，主要从事酶工程及生物材料方面的研究工作(E-mail)maoyy@hyit.edu.cn。

TQ645;TK63

A

1003-7969(2017)01-0052-04