衰老相关基因Klotho的研究进展

郭煜晖 胡大军 陈 静 彭丹丽 李玉婷

(三峡大学，湖北 宜昌 443002)

衰老相关基因Klotho的研究进展

郭煜晖 胡大军1陈 静 彭丹丽 李玉婷

(三峡大学，湖北 宜昌 443002)

衰老；Klotho基因

随着衰老研究及分子生物学的迅猛发展，衰老机制的研究已经走向分子与基因水平。Klotho基因是哺乳动物体内第一个过表达延长生命、低表达加速衰老的衰老抑制基因。Klotho基因在抗衰老及衰老相关疾病的发生中发挥着极为重要的作用，现将这方面的研究综述如下。

1 Klotho基因的生物学属性

Kuro-o等〔1〕首次从衰老小鼠中成功克隆Klotho基因，随之发现大鼠和人也有Klotho基因，且它们之间具有较高(83%)的同源性。人和小鼠Klotho基因定位在第13号染色体区域，大鼠Klotho基因定位在第12号染色体区域，全长50 kb，包含5个外显子。在Klotho基因结构中，其mRNA存在一个可变剪切位点，故而可产生膜型与分泌型两种蛋白产物。人的膜型Klotho蛋白主要表达在肾脏、小肠、胎盘等脏器；分泌型Klotho蛋白与模型分布大致相同，分泌型Klotho蛋白无跨膜、胞内结构，主要以通过游离的形式行使其功能，血清中也含有Klotho蛋白〔2〕。Klotho基因突变的小鼠会过早出现与人类衰老相似的症状，且寿命缩短，而其过度表达会使小鼠寿命延长〔3〕。

2 Klotho基因的功能

2.1 保护肾脏 Kuro-o等〔1〕发现Klotho在肾脏中高表达，免疫组化和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析表明，Klotho基因高表达仅限于肾脏和脑脉络膜〔4〕。Sugiura等〔5〕通过手术建立双侧肾损伤的大鼠模型，肾脏Klotho mRNA及其蛋白水平均明显下降，需要很长时间才能恢复到对照组的水平；而经转入Klotho基因处理后，治疗组组织损伤程度小，血浆肌酐水平正常、凋亡细胞数量少，说明Klotho基因在肾脏损伤的恢复过程中发挥了重要作用。Haruna等〔6〕发现肾小球肾炎(ICGN)小鼠模型转入Klotho(ICGN/ Klotho TG)处理后，较对照组其血肌酐水平、尿蛋白总量有所下降，此外，细胞间质、毛细血管、系膜等形态学方面均有明显改善，死亡率明显降低，并认为Klotho基因可以保护肾脏。有学者研究，给大鼠持续少量泵入两个银原子(AgⅡ)，7 d后可出现肾损伤，出现蛋白尿增多，肾小球滤过率下降，转入Klotho基因后，可使大鼠尿蛋白减少，并能防止肾小球滤过率进一步下降及小管上皮细胞的形态学损伤〔5〕。通过转Klotho基因处理可上调抗感染性细胞因子白细胞介素(IL)-10表达，抑制氮氧化物和过氧化产物的生成，从而减轻肾损伤，保护肾脏〔7〕。

2.2 保护动脉 人类衰老过程与内皮细胞功能障碍密切相关，衰老是动脉粥样硬化危险因素之一。出生4 w后的Klotho基因缺陷小鼠就出现主动脉、肌性动脉的粥样硬化，转入外源性Klotho基因的互补脱氧核糖核酸(cDNA)后，动脉硬化得到有效改善〔1〕。Nakamura等〔8〕发现，和野生型Klotho+/+大鼠相比，Klotho-/+大鼠的内皮细胞功能受损，一氧化氮(NO)生成减少，对乙酰胆碱的血管舒张反应随之降低，血管内皮生长因子(VEGF)表达降低，VEGF可修护血管内皮，延缓细胞衰老〔9〕。这也表明血管内皮细胞NO与VEGF的合成都和Klotho基因的表达相关，Klotho基因可能通过促进NO合成和上调VEGF表达防止血管内皮细胞的衰老。Ohta等〔10〕把含有Klotho基因的质粒转入Klotho基因敲出小鼠体内1 w，小鼠体内的超氧化物歧化酶(SOD)活力明显提高，脂质过氧化物的生成减少，血浆中NO含量也升高，所以认为Klotho基因可以协调体内氧化与抗氧化间的平衡，保护血管内皮细胞功能。

2.3 对钙、磷代谢的调节 Klotho基因敲除小鼠钙、磷代谢明显异常〔11〕。在1～2周龄的Klotho基因敲除小鼠就有高磷血症和高钙血症表现，随周龄的增长，钙、磷代谢失调日趋严重。高钙血症使得主动脉血管中层钙化，累及肾小血管受损。Tsujikawa等〔11〕发现限制维生素D的摄入可使Klotho-/-的小鼠血钙、血磷、1，25二羟基维生素D3〔1,25-(OH)2D3〕浓度恢复正常、纠正各种衰老表现并延长其寿命(生存15 w以上)。而限制磷的摄入可纠正(FGF)23-/-小鼠的高磷血症、各种衰老表现并延长其寿命〔12〕。研究发现，膜型Klotho蛋白可明显增加纤维母细胞生长因子(FGF)23和受体的亲和力，还可与FGF23一起抑制1α-羟化酶的基因Cyp27b1表达，从而减少1,25-(OH)2D3的合成〔13〕。因甲状旁腺也表达模型Klotho，甲状旁腺激素(PTH) 也是FGF23作用的一个靶器官，PTH可以增加Cyp27b1基因的表达和血浆中1,25(OH)2D3的水平，同时FGF23可增加编码24-羟化酶的基因Cyp24表达，抑制肾脏对磷的重吸收和维生素D的生物合成〔14〕，血浆中FGF23水平升高后可造成磷的丢失和骨骼骨化功能障碍〔15〕。可见，Klotho与 FGF23共同完成钙、磷的调节。

2.4 抗氧化与抗凋亡 活力氧(ROS)对组织损伤的作用日趋明显，如氧化应激是急性肾损伤的重要发病因素之一，可以采取清除氧自由基的方法治疗。应激下动物体内Klotho mRNA及其蛋白表达降低。Mitobe等〔16〕发现在过氧化氢诱导的氧化应激状态下，小鼠肾脏Klotho基因表达下降低，肾内髓集合管3细胞凋亡增多，而此变化与时间、剂量改变呈正相关，可作为氧化应激下组织细胞凋亡的一项指标〔17〕。Haruna等〔6〕发现，在40 w时相比转Klotho基因小鼠的肾组织凋亡细胞数，肾小球肾炎的小鼠模型明显增多，凋亡蛋白Bax表达的上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。Yamamoto等〔18〕观察通过Klotho高表达转基因小鼠(EFmKLOTHO48)和野生小鼠尿中活体内DNA氧化损伤的生物标记(8-OhdG)的分泌量发现，野生型小鼠尿中8-OhdG分泌量明显增多，为EFmKLOTHO48鼠的1倍，提示Klotho能对抗体内DNA的氧化损伤；百草枯是一种农用除草剂，能生成过氧化物。把百草枯放入HeLa细胞的培养基里，将可溶性的Klotho蛋白加入处理组中，观察它们各自细胞脂质过氧化的变化。相比对照组，处理组的脂质过氧化较轻;此外，将加入百草枯中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养基与经过可溶性Klotho蛋白处理的处理组比较，发现处理组细胞凋亡明显减少，上述实验均可证明Klotho基因可以减少细胞凋亡，具对抗氧化应激。

3 Klotho基因抗衰老的主要机制

Kurosu等〔19〕用EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48与相同基因的野生小鼠比较，发现EFmKLOTHO46和EFmKLOTHO48两组的小鼠寿命长。Ikushima等〔20〕人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用Klotho蛋白处理后发现，衰老相关的β-半乳糖酐酶活性降低，p53与p21的表达明显下降，说明Klotho基因通过抑制p53/p21的表达减缓细胞衰老。

Klotho基因的分泌型Klotho蛋白通过提高解毒有害ROS的能力，行使与抗衰老激素一样的功能。Klotho基因过表达的小鼠体内Klotho蛋白表达增强时，胰岛素含量也随之升高；反之，Klotho基因缺陷小鼠体内Klotho基因缺失时，胰岛素含量也随之下降，这种小鼠对胰岛素敏感度很高，可以得知Klotho蛋白与胰岛素含量变化密切相关，参与胰岛素的抗性全过程〔19〕。当使用遗传学方法对Klotho基因缺陷小鼠同时进行胰岛素(INS)/胰岛素样生长因子(IGF)-1通路干涉处理后，可使Klotho基因缺陷小鼠的衰老症状明显缓解。

Klotho基因能调控多个离子通道和生长因子的活动，包括INS、IGF-1和Wnt，对多种靶器官发挥生理效应〔21,22〕。Klotho蛋白通过与细胞膜表面特定受体结合而启动了胞内的信号转导过程，该信号传递可以抑制其下游的INS和IGF-1的胞内信号传递，因此出现胰岛素抗性，如特定的靶酶磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB又称为Akt)的磷酸化过程均被抑制〔23〕，而导致Akt的去磷酸化,后者又抑制叉头转录因子(FOXO)1、FOXO3a、FOXO4等转录因子的磷酸化。FOXO家族成员FOXO1、FOXO3a、FOXO4在信号转导通路上起了很重要的作用，Kyoung Kim等〔24〕筛选出稳定表达FOXO3a siRNA的人二倍体成纤维细胞(HDFs),发现下调HDFs中FOXO3a RNA和蛋白导致许多衰老形态出现,包括细胞形态的改变、细胞增殖速度减慢、SA-β-gal染色增加及上调p53/p21蛋白的表达。FOXO3a的活力可受磷酸化、乙酰化和蛋白水解调节,其中磷酸化是最主要的调节方式，而PI3K/Akt又是磷酸化FOXO3a最重要的信号通路。一旦INS/IGF-1/PI3K/Akt信号转导通路被抑制就会激活FOXO，而抑制FOXO的磷酸化，并促进它的核迁移〔25〕。进而直接调控并且促进SOD2(MnSOD)的表达，有利于活性氧类物质撤除和对氧化应激的抵抗，并最终抑制衰老〔18,26〕。以上研究表明，Klotho蛋白通过调节细胞信号转导通路而达到抗衰老，且抗衰老作用与抵抗氧自由基紧密相关。

综上，Klotho基因同时具有配体、受体和酶的功能，有调节钙磷代谢、抗氧化、抗凋亡的作用并以此实现对脏器的保护，在衰老过程中所起的作用日益明确，为揭示衰老发生机制提供了可靠的依据。进一步对Klotho蛋白的具体信号转导通路的过程(其中涉及信号转导体及这些信号与其他衰老途径的关系)进行研究，有望在实践中通过对Klotho基因表达的调控对衰老及衰老相关疾病提供一种新的治疗方法。

1 Kuro-o M,Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕 .Nature,1997；390(6655):504-12.

2 Xiao NM,Zhang YM,Zheng Q，etal.Klothootho is a serum factor related to human aging〔J〕.Chin Med J (Engl),2004；117(5):742-7.

3 Wang Y，Sun Z.Current understanding of klotho〔J〕.Aging Res Rev，2009；8(1)：43-51.

4 Kuro-o M.Klotho as a regulator of oxidative stress and senescence〔J〕.Biol Chem，2008；389(3)：233-41.

5 Sugiura H,Yoshida T，Tsuchiya K，etal.Klotho reduces apoptosis in experimental ischaemic acute renal failure〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2005；20(12):2636-45.

6 Haruna Y,Kashihara N，Satoh M ，etal.Amelioration of progressive renal injury by genetic manipulation of Klotho gene 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2007；104(7):2331-6.

7 Wang YH，Sun ZJ.Klotho gene delivery prevents the progression of spontaneous hypertension and renal damage 〔J〕.Hypertension，2009；54(4)：810-7.

8 Nakamura T,Saito Y,Ohyama Y，etal.Production of nitric oxide,but not prostacyclin,is reduced in klotho mice〔J〕.Jpn J Pharmacol,2002；89(2):149-56.

9 Watanabe Y,Lee SW,Detmar M，etal.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) delays and induces escape from senescence in human dermal microvascular endothelial cells〔J〕.Oncogene,1997；14(17):2025-32.

10 Ohta J,Rakugi H,Ishikawa K,etal.Klotho gene delivery suppresses oxidative stress in vivo〔J〕.Geriatr Gerontol Int,2007；(7):293-9.

11 Tsujikawa H,Kurotaki Y,Fujimori T，etal.Klotho,a gene related to a syndrome resembling human premature aging,functions in a negative regulatory circuit of vitamin D endocrine system〔J〕.Mol Endocrinol,2003；17(12):2393-403.

12 Saito H,Kusano K,Kinosaki Metal.Human fibroblast growth factor-23 mutants suppress Na+-dependent phosphate cotransport activity and alpha,25-dihydroxyvitamin D3 production〔J〕.Biol Chem 2003;278:2206-2211.

13 Manya H,Akasaka-Manya K,Endo T.Klotho protein deficiency and aging.〔J〕.Geriatr Gerontol Int，2010;10 (Suppl 1):S80-7.

14 袁 丹,陈海平.Klotho基因与肾脏衰老关系的基础研究进展〔J〕.实用老年医学，2010；24(3):242-5.

15 朱 晶.成纤维细胞生长因子23与慢性肾脏病患者钙磷代谢的关系〔D〕.沈阳：中国医科大学,2010：8-9.

16 Mitobe M,Yoshida T，Sugiura H，etal.Oxidative stress decreases klotho expression in a mouse kidney cell line〔J〕.Nephron Exp Nephrol,2005；101(2):67-74.

17 Padanilam BJ.Cell death induced by acute renal injury:a perspec-tive on the contributions of apoptosis and necrosis〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2003；284(4):608-27.

18 Yamamoto M,Clark JD，Pastor JV，etal.Regulation of oxidative stress by the anti-aginghormone klotho〔J〕.J Biol Chem,2005；280(45):38029-34.

19 Kurosu H,Yamamoto M，Clark JD，etal.Suppression of aging in mice by the hormone Klothootho〔J〕.Science,2005；309(5742):1829-33.

20 Ikushima M,Rakugi H，Ishikawa K，etal.Anti-apoptotic and anti-senescence effects of Klothootho on vascular endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006；339(3):827-32.

21 Li SA,Watanabe M,Yamada H，etal.Immunohistochemical localization of Klothootho protein in brain，kidney，and reproductive organs of mice〔J〕.Cell Struet Funet,2004；29:91-9.

22 Kuro-o M.Klothootho and aging〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009；1790(10):1049-58.

23 Bartke A.Long-lived Klothootho mice:new insights into he roles of IGF-1 and insulin in aging〔J〕.Trends Endoerinol Metab,2006；17:33-5.

24 Kyoung Kim H,Kyoung Kim Y,Song IH,etal.Down-regulation of a forkhead transcription factor,Foxo3a,accelerates cellular senescence in human dermal fibroblasts〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2005；60(1):429.

25 McClung JM,Kavazis AN,Whidden MA,etal.Antioxidantadminis-tration attenuates mechanical ventilation-induced rat diaphragm muscle atrophy independent of protein kinase B (PKB Akt) signalling〔J〕.J Physiol,2007；585(1):203-15.

26 Papanicolaou KN,Izumiya Y,Walsh K.Forkhead transcription factors and cardiovascular biology〔J〕.Circ Res,2008；102(1):16-31.

〔2015-10-16修回〕

(编辑 苑云杰/杜 娟)

国家自然科学基金青年项目(81403307)

郭煜晖(1983-)，女，博士，副教授，主要从事藏象理论及衰老研究。

R339.3+8

A

1005-9202(2017)03-0759-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.105

1 宜昌市第二人民医院 三峡大学第二人民医院