CXCL1在重度脑外伤患者中的表达和意义

刘苏，孙李颖，孙丽，吴勤峰，沈光宇

CXCL1在重度脑外伤患者中的表达和意义

刘苏1，孙李颖2，孙丽1，吴勤峰1，沈光宇1

目的研究趋化因子CXCL1在重度脑外伤(TBI)患者脑组织中的细胞定位及在脑组织和血液中的表达，探讨其与损伤严重程度的关系。方法2013年9月至2015年10月，选取重度TBI住院、且行开颅手术患者78例为实验组，所有患者均收集血液，其中19例收集到脑组织。实验组根据入院时格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分分为重型TBI组(6～8分，n=35)和特重型TBI组(3～5分，n=43)。10例病例对照组脑组织标本来自摘除的脑血管瘤或良性肿瘤边缘少量正常脑组织。10例健康对照组血液来自同期在本院健康体检正常者。采用免疫荧光双标法检测重度TBI患者CXCL1在脑组织中的细胞定位；ELISA法检测损伤后脑组织和不同时间点血液中CXCL1蛋白的表达；Spearman相关分析对不同时间点外周血中CXCL1蛋白含量与术后30 d格拉斯哥结局量表(GOS)评分进行相关性分析。结果正常脑组织内CXCL1主要表达在星形胶质细胞；重度TBI后，CXCL1主要表达在神经元和星形胶质细胞。特重型TBI组CXCL1蛋白在脑组织中的含量高于重型TBI组(t=-12.58,P＜0.05)。重型TBI组CXCL1蛋白在血液中含量于术前达高峰，随后逐渐下降，术后14 d仍高于健康对照组(P＜0.05)，术后30 d降至健康者水平(P＞0.05)。特重型TBI组CXCL1蛋白在血液中含量术前和术后1 d最高，其后逐渐下降，术后30 d仍高于健康者(P＜0.05)。术前至术后30 d，特重型TBI组CXCL1蛋白含量均高于重型TBI组(P＜0.05)。特重型TBI组术前血液中CXCL1蛋白含量与GOS评分呈负相关(r=-0.351,P＜0.05)。结论重度TBI后CXCL1表达明显增高，且主要表达在神经元和星形胶质细胞，同时CXCL1含量在一定程度上可以反映脑损伤的严重程度和预后。

脑外伤；CXCL1；表达；免疫荧光染色；相关性分析

[本文著录格式]刘苏，孙李颖，孙丽，等.CXCL1在重度脑外伤患者中的表达和意义[J].中国康复理论与实践,2017,23(8):937-941.

CITED AS:Liu S,Sun LY,Sun L,et al.Expression and role of CXCL1 in patients with severe traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(8):937-941.

脑外伤(traumatic brain injury,TBI)是致死致残率最高的疾病之一，常遗留有认知、言语及运动功能障碍，严重危害人类生命安全和生活质量。TBI造成的脑组织损害分原发性损伤和继发性损伤，其中神经炎症反应是TBI后继发性损伤的重要原因之一，可持续数月甚至数年，导致神经功能受损[1-2]。

趋化因子是参与神经炎症反应的重要物质。我们前期动物研究和文献报道研究表明，TBI后趋化因子迅速升高诱发或参与神经炎症级联反应，而相关临床研究未见报道[3-5]。本研究旨在观察趋化因子CXCL1 (chemokine(C-X-C motif)ligand 1)在重度TBI患者脑组织中的细胞定位及在脑组织和血清中的表达变化，探讨CXCL1在TBI中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2013年9月至2015年10月，选取南通大学附属医院因重度TBI住院行开颅手术患者78例为实验组。

实验组纳入标准：①明确高空坠落、车祸等外伤史，通过CT或MRI诊断明确；②入院时格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale,GCS)评分3～8分；③入院后当天行清除血肿及碎裂脑组织开颅手术；④无心、肺、肝、肾等重要脏器严重病变。

实验组根据入院时GCS评分再分为重型TBI组(6～8分，n=35)和特重型TBI组(3～5分，n=43)。所有患者均收集到血液，年龄22～76岁，平均(52.74± 14.44)岁；其中有19例(重型TBI组9例，特重型TBI组10例)收集到脑组织，样本来自手术中吸除的碎裂脑组织，年龄25～64岁，平均(49.68±10.73)岁，其中2例患者(特重型TBI组)术后第2天死亡。

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病例对照组脑组织样本来自于同期本院神经外科诊断为脑血管瘤或良性肿瘤需行开颅手术且排除TBI及其他中枢出血、梗死、恶性肿瘤等疾病的患者，术后已经病理检查明确诊断，取摘除的血管瘤或良性肿瘤边缘少量正常脑组织，共10例，年龄39～62岁，平均(50.50±6.60)岁。

健康对照组血液来自同期在我院健康体检正常者，共10例，年龄23～65岁，平均(51.22±12.09)岁。

脑组织及血液标本的获取均经患者或其家属同意，并通过南通大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 脑组织中CXCL1的细胞定位

采用免疫荧光双标染色法检测脑组织中CXCL1的细胞定位。将甲醛固定后脑组织进行蔗糖梯度脱水和冰冻切片，于0.01 mol/L PBS溶液中清洗，加入5%羊血清封闭液室温孵育2 h后，加入2.5%羊血清抗体稀释液稀释的一抗，4℃过夜。具体一抗如下：兔抗人CXCL1(1∶50，武汉博士德)和小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)(1∶6000，MERCK MILLIPORE)或小鼠抗人NeuN(1∶1000，MERCK MILLIPORE)或大鼠抗人CD11b(1∶50，ABD SEROTEC)。

用0.01 mol/L PBS清洗玻片后加入0.01 mol/L PBS稀释的二抗，室温下避光孵育2 h。具体二抗如下：Alexa Fluor 488-羊抗小鼠-IgG(1∶1000，INVITROGEN)、Alexa Fluor 488-羊抗大鼠-IgG(1∶1000，INVITROGEN)和Cy3-羊抗兔-IgG(1∶1000，INVITROGEN)。避光条件下用0.01 mol/L PBS清洗，行组织切片裱片，于荧光显微镜下观察并摄片。

1.3 脑组织和外周血中CXCL1蛋白表达

采用ELISA法检测脑组织和外周血中CXCL1蛋白表达。分别在术前，术后1 d、3 d、7 d、14 d及30 d检测外周血中CXCL1蛋白含量。将ELISA试剂盒(武汉博士德)放在室温平衡30 min，直接加已用样品稀释液稀释的样本。严格按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤加入生物素抗人CXCL1抗体工作液、ABC工作液、TMB显色液，最后用TMB终止液终止反应。用酶标仪测定各孔在450 nm波长下的光密度(optical density,OD)值。根据标准品制备的标准曲线，计算各样本中的CXCL1蛋白。

采用格拉斯哥结局量表(Glasgow Outcome Scale, GOS)在术后30 d进行评估以判断预后，分为1分(死亡)、2分(持续性植物状态)、3分(重度残疾)、4分(中度残疾)和5分(恢复良好)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据均以(xˉ±s)表示，两两比较采用t检验，组间分析采用双因素方差分析。采用Spearman相关分析对不同时间点外周血中CXCL1蛋白含量与术后30 d GOS评分进行相关性分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 脑组织内CXCL1的细胞分布

本实验采用免疫荧光法分别对CXCL1及神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞进行染色，通过荧光显微镜摄片，发现CXCL1在正常脑组织中主要与星形胶质细胞的标记物GFAP共标，与神经元的标记物NeuN和小胶质细胞的标记物CD11b没有共标(见图1)；重度TBI后与星形胶质细胞和神经元标记物均有共标(见图2)。

2.2 脑组织CXCL1蛋白表达

特重型TBI组CXCL1蛋白在脑组织中的含量高于重型TBI组(P＜0.05)。见表1。

2.3 血液中CXCL1蛋白表达

重型TBI组CXCL1蛋白在血液中的含量于术前达高峰，随后逐渐下降，术后14 d仍高于健康对照组(P＜0.05)，术后30 d降至健康者水平(P＞0.05)。特重型TBI组术前和术后1 d CXCL1蛋白含量最高，其后逐渐下降，术后30 d仍高于健康者(P＜0.05)。术前至术后30 d，特重型TBI组CXCL1蛋白含量均高于重型TBI组(P＜0.05)。见表2。

2.4 血液中CXCL1蛋白含量与GOS评分的相关性

重型TBI组不同时间点血液中CXCL1蛋白含量与GOS评分不相关(P＞0.05)；特重型TBI组术前血清中CXCL1蛋白含量与GOS评分呈负相关(P＜0.05)，其他时间点含量与GOS评分不相关(P＞0.05)。见表3～表4。注：a.重型TBI组与特重型TBI组比较。重型TBI组和特重型TBI组与健康对照组比较，除重型TBI组术后30 d外，其余均P＜0.05

3 讨论

TBI后神经炎症反应往往伴随着脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，趋化因子快速大量增加，这些因子在调节神经细胞功能方面起着重要作用[6-7]。本研究通过免疫荧光双标染色发现，正常脑组织中CXCL1主要表达在星形胶质细胞，重度TBI后CXCL1主要表达在神经元和星形胶质细胞，提示CXCL1的表达上调与激活的星形胶质细胞有关，有可能结合相应受体作用于神经元。

CXCL1属于CXC趋化因子家族，广泛存在于神经系统中，是脑和脊髓外伤、神经退行性疾病、癫痫、多发性硬化、脑局部缺血等多神经系统病变重要的炎性介质之一[8-12]。已有动物研究证实，大鼠TBI后损伤区皮层趋化因子CXCL1在4 h内表达达到峰值，且维持时间长，有可能作为TBI的标记物[3]。在TBI急性期，CXCL1增高的同时中性粒细胞随之聚集到脑损伤区[13]。Joanna等[14]研究也指出，大鼠TBI后脉络膜上皮细胞通过分泌CXC趋化因子参与中性粒细胞的浸润作用，提示CXCL1在TBI后炎症反应中起重要作用。

本研究进一步发现，重型TBI患者和特重型TBI患者脑组织中CXCL1含量均明显增高，且高于血液中含量。重型TBI患者CXCL1蛋白在血液中的含量于术前达高峰，术后14 d仍高于健康者，术后30 d降至健康者水平。特重型TBI患者CXCL1在术前和术后1 d含量最高，其后逐渐下降，术后30 d仍高于健康者。同时，术前至术后30 d，特重型TBI患者CXCL1均高于重型TBI组，显示损伤越重，CXCL1在人体血液中的含量越高，说明CXCL1含量在一定程度上可以反映TBI患者脑损伤的严重程度。相关性分析研究显示，特重型TBI患者术前外周血清中CXCL1含量与患者术后30 d GOS评分呈负相关，提示CXCL1含量高的患者预后不良。

CXCL1的主要作用受体是趋化因子受体2(chemokine C-C motif receptor 2,CXCR2)，CXCR2基因敲除动物脑损伤后中性粒细胞浸润明显下降，组织破坏减轻，同时神经元凋亡和细胞死亡减少，CXCR2拮抗剂未来可能会用于治疗TBI后神经炎症反应[15]。

综上所述，趋化因子CXCL1在重度TBI患者的神经炎症中可能发挥着重要的作用，但其具体作用机制尚不明确，有待于进一步研究。也许在未来CXCL1可以作为生物标记物用于判断TBI的严重程度分级和预后，也有可能作为临床治疗的新靶点，减轻损伤后脑内神经炎症反应，从而减轻继发性损伤，促进神经功能恢复。

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Expression and Role of CXCL1 in Patients with Severe Traumatic Brain Injury

LIU Su1,SUN Li-ying2,SUN Li1,WU Qin-feng1,SHEN Guang-yu1
1.Department of Rehabilitation Medicine,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong,Jiangsu 226001, China;2.Changzhou Maternal and Child Health Care Hospital,Changzhou,Jiangsu 213003,China

SHEN Guang-yu.E-mail:sgyrm@163.com

ObjectiveTo explore the cellular localization of chemokine(C-X-C motif)ligand 1(CXCL1)in brain tissue and its expression in brain tissue and blood in patients with severe traumatic brain injury(TBI),as well as its correlation with the injury severity.Methods From September,2013 to October,2015,78 cases of TBI with craniotomy admitted to our hospital were involved as TBI group.A total of 78 peripheral blood samples and 19 brain tissue samples were studied.According to the scores of Glasgow Coma Scale(GCS)at admission,the TBI group was classified as severe TBI group(6～8,n=35)and particularly severe TBI group(3～5,n=43).Ten cases of control brain tissue were taken from patients with cerebral aneurysms or benign tumor and also undergoing craniotomy during the same time.Peripheral blood from ten healthy people were involved as the healthy control group.Immunofluorescent double staining was used to detect the cellular localization of CXCL1 in brain tissues,and ELISA was used to detect the expression of CXCL1 in brain tissue and blood.The relationship between the level of CXCL1 in peripheral blood at different time and the score of Glasgow Outcome Scale(GOS)was analyzed with Spearman correlation analysis.Results In normal brain tissue,CXCL1 mainly localized in astrocytes.For severe TBI,CXCL1 mainly expressed in neurons and astrocytes.The level of CXCL1 was higher in brain tissue in the particularly severe TBI group than in the severe TBI group (t=-12.58,P＜0.05).In the severe TBI group,the level of CXCL1 in blood reached a peak before surgery,then gradually decreased,and was still higher than that in the healthy control group 14 days after surgery(P＜0.05),however,no significant difference was found 30 days after surgery compared to the healthy control group(P＞0.05).In the particularly severe TBI group,the level of CXCL1 in blood reached a peak before and one day after surgery,then gradually decreased,and was still higher than that in the healthy control group 30 days after surgery (P＜0.05).The level of CXCL1 in blood was higher in the particularly severe TBI group than in the severe TBI group at all time points(P＜0.05),and the level before surgery was negatively correlated with the score of GOS in the particularly severe TBI group(r=-0.351,P＜0.05). Conclusion The CXCL1 protein of injury brain tissue was mainly colocalized in neurons and astrocytes in severe TBI patients,and the expression was associated with injury severity and outcome.

traumatic brain injury;chemokine(C-X-C motif)ligand 1;expression;immunofluorescence staining;correlation analysis

R651.1

A

1006-9771(2017)08-0937-05

2017-02-27

2017-05-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.08.014

1.南通大学博士科研启动基金项目(No.2016-2)；2.南通市科技计划项目(No.MS22016044)。

1.南通大学附属医院康复医学科，江苏南通市226001；2.常州市妇幼保健院，江苏常州市213003。作者简介：刘苏(1977-)，女，汉族，江苏扬州市人，博士，副教授，主要研究方向：中枢神经系统损伤与修复。通讯作者：沈光宇。E-mail:sgyrm@163.com。