牛支原体病诊断技术研究

董亚旗，朱习芳，李程，陈颖钰，索朗斯珠，郭爱珍

（1.西藏大学农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；3.华中农业大学动物医学院，武汉 430070）

牛支原体病诊断技术研究

董亚旗1,3，朱习芳2,3，李程1,3，陈颖钰2,3，索朗斯珠1，郭爱珍2,3

（1.西藏大学农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；3.华中农业大学动物医学院，武汉 430070）

近年来，牛支原体对世界养牛业尤其是肉牛、奶牛养殖业的威胁日渐严重，在如何控制牛支原体的传播和降低经济损失中，快速准确诊断牛支原体病备受关注。随着研究的深入，针对牛支原体的诊断技术不断被开发。本文从兽医流行病学、临床病理学、细菌学、免疫学、分子生物学等方面综述了牛支原体病的诊断技术，以期能够为该病的早期治疗和防控提供依据。

牛支原体；诊断；支原体；肺炎；乳腺炎

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）是一种介于细菌和病毒之间、能自由生活且没有细胞壁的最小微生物，是牛的一种重要致病菌，最早出现在欧洲、北美等地区，之后在世界范围内普遍存在，造成的经济损失非常严重[1]。1961年Hale等在美国首次从乳腺炎患牛的牛奶中分离出牛支原体，1976年鉴定其与呼吸道疾病有关，除主要引起牛肺炎和乳腺炎外，还导致关节炎等多种病症[2,3]。我国于1983年首次从患乳腺炎奶牛的奶中分离到牛支原体，2008年首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[4,5]。

目前，临床上还未有牛支原体防治的特效药物及疫苗，而耐药菌株却在不断出现，更给牛支原体病的防控造成极大困难[6～8]。由于牛感染牛支原体后不表现典型的临床症状，且临床上多以混合感染的形式出现，因此早期准确诊断对于牛支原体病的确诊、及时治疗、减少损失等意义重大。目前牛支原体诊断技术主要包括流行病学和临床症状、病理学观察、细菌学、分子生物学及免疫学技术等方面。综合运用多种技术有助于提高诊断的灵敏性和特异性。

1 流行病学

研究发现，运输应激与牛支原体肺炎的暴发密切相关。随着国内国际牛业贸易的迅速发展，牛支原体肺炎已呈全球传播趋势[9,10]。在欧洲，由牛支原体引起的呼吸道疾病约占犊牛呼吸道疾病的25%～35%，法国的牛支原体发生率为30%，英国为20%～25%[11,12]。我国于2008年首次报道肉牛流行牛支原体肺炎，平均病死率10%，最高可达40%以上[13]。

新生犊牛的牛支原体肺炎与母牛发生牛支原体乳腺炎相关，犊牛吸吮含有牛支原体的初乳和常乳感染，15日龄左右出现典型症状，包括呼吸道症状和关节炎等[14]。

2 临床和病理学诊断

2.1 肺炎型

牛感染牛支原体后，根据病程长短可分为急性型和慢性型。急性型病牛精神沉郁，高热，食欲减退或废绝，伴有间歇性的咳嗽、气喘，鼻腔有清亮分泌物；后期转变为黏性或脓性鼻液，形体消瘦、体重减轻，被毛粗乱无光[13]；并可继发中耳炎、关节炎、坏死性咽炎、难产、流产等疾病，严重者出现死亡，犊牛病情相对严重，死亡率可达50%[15～17]；慢性型无明显临床症状。

牛支原体感染后的病变部位主要在胸腔和肺。剖检患牛，可观察到皮下有结节，轻者可见膈叶、心叶及肺脏尖叶有红色肉变区，肺脏与胸膜轻度粘连；重者心包积液，液体黄色透亮；胸水增多，液体黄色透亮；肺部发生大面积肉变区，分布很多化脓灶或干酪样坏死灶，肺部质地变硬[18]；肾局部出血，肾小管上皮细胞发生透明滴样变或颗粒变性，部分细胞坏死脱落形成管型；淋巴结被膜和小梁均表现水肿，间隙增大，淋巴窦扩张，其间有免疫细胞浸润[19]。

2.2 乳腺炎型

牛支原体乳腺炎多发于奶牛，临床上可分为慢性型和急性型。慢性型：主要为亚临床感染, 症状不明显，有时出现间歇性急性发作，有时可见关节炎、跛行、繁殖障碍。急性型：患牛精神沉郁，食欲减退，奶产量急剧下降；多个乳区有急性炎症，乳区发热，乳房肿涨，触诊呈捏粉样感觉；乳汁外观不一，早期为水样，并有“沙粒样”絮状物, 渐而为黄色浆液样物质、凝块、絮片状物或脓样。

根据临床症状只能初步诊断为牛支原体病，确诊还需实验室进一步诊断。

3 细菌学诊断技术

支原体和L型细菌具有某些相似的特性，如均无细胞壁、形态呈多形性、在固体培养基上的菌落为“油煎蛋”状等，但两者仍存在明显特性差别：支原体可在自然条件下生长，生长需要固醇类物质，而L型细菌常常是实验中形成的，有抗生素的压力，不依赖固醇类物质即可生长；L型细菌较大，直径可达50μm，支原体较小，直径为0.1～0.8μm；支原体的基因组比L型细菌小，支原体C+G的含量一般在23%～41%，而L型细菌的C+G含量一般高于41%；在无抗生素等诱导物下连续培养5代以上，支原体菌无返祖现象，而L型细菌在除去诱导物情况下易返祖成母菌形态。

细菌学诊断技术通常是指对待检测样本进行牛支原体的分离培养鉴定。采集牛支原体侵袭过的靶组织，无菌操作将小块组织研磨涂于PPLO固体培养基上，于37℃、5%CO2条件下培养，同时加入适量的无菌生理盐水将小组织块研磨，过滤到PPLO液体培养基中同样条件下培养；2～3d后低倍光学显微镜下观察菌落形态，牛支原体菌落呈“煎蛋样”生长，液体培养基由红色透亮变成黄色浑浊[4]。再依据牛支原体不能分解糖类和精氨酸而能够分解乳酸等有机酸、可以氧化丙酮获取能量、可利用甘油作为碳源等生化特性，辅以配套的生化试验可对牛支原体进行初步鉴定[20]。虽然这是鉴定牛支原体的经典方法，但存在耗时过多、中间环节复杂、培养条件要求高等缺陷，给牛支原体的临床分离带来了一定的困难，不适合临床快速诊断。

牛支原体通常和多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌、溶血曼氏杆菌、 嗜昏睡嗜血杆菌、牛呼吸道合胞体病毒、牛疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒以及副流感病毒3型等病原混合致病。混合感染病原体的鉴定有助于对牛支原体进行综合治疗与预防。

4 免疫学诊断技术

4.1 血清学检测技术

血清学检测技术具有特异性较高、灵敏度较好、快速、易于操作等优点，非常适合临床样本的快速检查和大规模的流行病学调查。牛感染牛支原体后，其蛋白抗原和脂质都可以激发机体免疫系统，而且血清中的牛支原体抗体可持续存在数月，因此血清抗体检测技术被认为是牛支原体病流行病学研究的重要手段之一[21]。

比利时、美国、加拿大、瑞士等国已经成功生产出商品化的牛支原体血清抗体检测试剂盒，但由于成本高、使用局限大等原因，难以在临床上推广应用；同时，检测灵敏度和特异性有待进一步提高。

国内对牛支原体病的研究起步晚，但已建立多种牛支原体血清学抗体检测技术，其中，使用全菌蛋白和特异性抗原来检测抗体的间接ELISA技术仍是主要的血清学检测技术。Han X 于2014年建立了一种基于抗体亲和力的检测方法，可有效区分野毒感染和疫苗免疫个体，敏感性可达96.0%，特异性可达95.8%，具有较好的应用前景[22]；Sun Z将利用牛支原体PDHB蛋白建立的间接ELISA方法与商业化ELISA试剂盒进行对比，同时对358份牛血清进行检测，阳性检出率分别为50.8%和39.9%[23]；除间接ELISA检测抗体外，竞争ELISA方法用于检测牛支原体也有报道：Fu P基于P48蛋白制备了单克隆抗体，并建立了直接竞争ELISA方法，对中国地区165份临床牛血清进行检测，并与两种商业化的间接ELISA试剂盒相对比，结果显示P48竞争ELISA技术不仅临床上具有更高的阳性检出率，而且在以20份阳性牛血清和20份阴性牛血清确定的抑制百分数临界值为32%的条件下，竞争ELISA具有特异性好、灵敏度高、操作简单等优点，可用于对大规模牛场进行牛支原体监测[24]；Farhan发现了牛支原体的一个新的抗原蛋白MbovP579，并建立了间接ELISA方法，此方法能在感染后7d检测到血清反应[25]，其对于临床样品的敏感性为90.2%，特异性为97.8%，均显著高于已有的商品化试剂盒。

但是，国内尚无商业化试剂盒供应市场。对于牛支原体病诊断而言，基于抗原检测的快检或批量检测技术有更好的应用前景，目前国内外市场上都缺少这类试剂盒。

4.2 免疫组化诊断技术

免疫组化技术是一门将组织学与免疫学相结合的技术，是在组织细胞原位，通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测[26]。此外，免疫组化可对结果进行追溯，尤其是其他的检测方法已检出牛支原体，而病原培养为阴性时，免疫组化技术就尤为重要。免疫组化技术一般作为病原分离的辅助技术，临床有很高的阳性检出率，有时可达100%[27]。

基于单克隆抗体建立的免疫组化技术可检测出牛支原体抗原在组织中的分布情况，不仅提高了牛支原体的分菌率，而且降低了由于细菌污染对分菌所造成的影响，具有敏感特异等优点[28]。但对于病情不重或者选择病灶部位出现偏差较大时，免疫组化则难以检测到牛支原体的存在。

5 分子生物学诊断技术

5.1 PCR诊断技术

在众多检测方法中，多聚酶链式反应（ploymerase chain reaction, PCR）是简便且行之有效的检测方法。Higuchi于2011年基于牛支原体菌株ATCC 25523建立了简易PCR技术，用于快速诊断由牛支原体引起的乳腺炎，3h可分析300个样品，敏感性和特异性高达98.7%～99.7%，适用于奶牛养殖场大规模筛选患牛支原体乳腺炎病牛[29]；用定量RT-PCR技术对牛奶样品检测，能快速识别因牛支原体感染而患乳腺炎的奶牛，提高成本效益，具有高度特异性，敏感性可达96.6%，适用于奶牛场对牛支原体的监测[30,31]。大罐奶PCR的建立不仅可通过对牛奶或奶制品中牛支原体的检测来监管牛场，还可以用于在种群水平上对牛支原体进行流行情况监测[32,33]。

牛支原体与无乳支原体的的同源性高达99%，仅通过16S rRNA基因难以确诊[34,35]。uvrC和oppD/F等特异性基因的不断发现，一定程度上增加了用PCR扩增来检测牛支原体的特异性。Bigna基于管家基因uvrC建立的RT-PCR技术，无需从牛奶和组织样品中提取DNA，具有操作简单、耗时短、灵敏度高等优点，适用于牛场对牛奶和临床组织样品进行牛支原体日常检测[36]。

可以预见，随着分子生物学技术的不断发展，PCR诊断技术的特异性和敏感性将不断提高，应用成本也将随之下降。应当积极引进这些技术，用于牛支原体等病原微生物的检测，继而扩展到临床应用，服务于生产实际。

5.2 环介导等温扩增诊断技术

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等在2000年建立的在恒温条件下对目的基因扩增的方法。该方法仅需要将扩增模板、dNTP、内外引物等按适当的比例混合，60℃恒温孵育1h即可实现高效扩增，在扩增产物中添加荧光染料SYBR Green I，根据颜色变化即可凭肉眼对结果作出判断，具有特异性好、灵敏度高、操作简单、耗时短、不需要专业的仪器设备等优点[37]。白智迪等根据牛支原体特异基因uvrC设计了4对引物，建立了能快速检测牛支原体的环介导等温扩增法，该方法适用于临床样本和活体培养物的检测[38]。Yumiko于2016年优化了LAMP诊断技术，证实灵敏性可达97.2%，特异性可达90.9%[39]。

6 结语

探索高效、精准、简单易行的诊断技术，对牛支原体病的早期治疗和控制、最大限度减免损失具有重大意义。针对不同的流行特点和实验室条件，采用相应诊断方法对牛支原体病的确诊十分必要。细菌学方法是诊断金标准，但耗时长，灵感性差；血清抗体技术简便快速，但由于牛支原体持续感染较普遍，检测的特异性差；抗原检测方法奇缺；分子生物学方法灵敏性高，但常需要预增菌，且因易污染而出现非特异性。配合使用多种方法，可有效补充各方法的不足，做到“早发现，早治疗”；同时，尚需积极开发新型诊断标识，提高现有检测方法的灵敏性和特异性。

[1] Sibylle B, Joachim E, Paola P.Virulence, persistence and dissemination of Mycoplasma bovis[J].Veterinary Microbiology, 2015,179：1-2.

[2] Passchyn P, Piepers S, De Vliegher S,et al. Between-herd prevalence of Mycoplasma bovis in bulk milk in Flanders, Belgium[J]. Res Vet Sci, 2012,92：219-220.

[3] Thompson G, Machado M, Carvalheira J,et al. Management practices associated with the bulk tank milk prevalence of Mycoplasma spp. in dairy herds in northwestern Portugal[J]. Prev Vet Med, 2013,108：21-27.

[4] Nicholas RAJ, Ayling RD.Mycoplasma bovis： disease, diagnosis, and control[J]. Research in Veterinary Science, 2003,74(2)：105-112.

[5] 胡长敏, 石磊, 龚瑞,等.牛支原体病研究进展[J].动物医学进展, 2009, 08： 73-77.

[6] Castillo-Alcala F, Bateman KG, Caswell JL, et al. Prevalence and genotype of Mycoplasma bovis in beef cattle after arrival at a feedlot[J]. Am J Vet Res, 2012,73(12)：1932-1943.

[7] Spergser, J., Macher, K., Rosengarten, R., et al. Emergence,reemergence, spread and host species crossing of Mycoplasma bovis in theAustrian Alps caused by a single endemic strain[J]. Vet Microbiol, 2013,164(3-4)： 299-306.

[8] 辛九庆,李媛,郭丹,等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 中国预防兽医学报, 2008,30(9)： 661-664.

[9] 胡长敏，郭爱珍.牛支原体病的流行特点与防控措施[J]. 兽医导刊, 2011, 11： 41-43.

[10] Ball H J, Nicholas R A.Mycoplasma bovis-associated disease：here, there and everywhere[J]. Vet J,2010, 186： 280-281.

[11] Arcangioli MA, Chazel M, Sellal E, et al. Prevalence of Mycoplasma bovis udder infection in dairy cattle：preliminary field investigation in southeast France[J]. N Z Vet J, 2011,59(2)：75-78.

[12] Ayling RD, Bashiruddin SE, Nicholas RA. Mycoplasma species and related organisms isolated from ruminants in Britain between 1990 and 2000[J]. Vet Rec, 2004,155(14)：413-416.

[13] 石磊, 龚瑞,郭爱珍,等. 肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步诊断[J]. 华中农业大学学报,2008, 4：572.

[14] Maunsell FP, Donovan GA. Mycoplasma bovis Infections in young calves[J]. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2009,25(1)：139-177.

[15] Dyer, N., Register, K.B.,Newell, T., et al.Necrotic pharyngitis associated with Mycoplasma bovis infections in American bison (Bison bison)[J]. J.Vet. Diagn. Invest, 2013,25：301-303.

[16] Register, K.B., Burrage, P.H.,Windeyer, M.C., et al. Systemic mycoplasmosis with dystocia and abortion in a North American bison (Bison bison) Herd[J]. J. Vet. Diagn. Invest, 2013,25：541-545.

[17] 姚永进, 剡根强,李岩,等.致犊牛肺炎和关节炎牛支原体新疆株的分离与鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2011,38(12)： 76-78.

[18] Maunsell FP, Donovan GA,Brown MB, et al.Field evaluation of a Mycoplasma bovis bacterin in young dairy calves[J]. Vaccine, 2009,27(21)：2781-2788.

[19] 蒋南, 翟研妮 ,郭爱珍,等.传染性牛支原体肺炎自然感染病牛的病理学观察[J]. 中国兽医科学,2011,09：933-935.

[20] Biddle MK, Fox LK, Hancock DD. Patterns of mycoplasma shedding in the milk of dairy cows with intramammary mycoplasma infection[J]. J Am Vet Med Assoc, 2003,223(8)：1163-1166.

[21] Wang Y, Liu S, Xin J,et al. Mycoplasma bovis-derived lipid-associated membrane proteins activate IL-1β production through the NF-κB pathway via toll-like receptor 2 and MyD88[J]. Dev Comp Immunol, 2016,55：111-118.

[22] Han X, Khan FA , Guo A,et al. Establishment of an antibody avidity test to differentiate vaccinated cattle from those naturally infected with Mycoplasma bovis[J]. Veterinary Journal, 2015,203(1)：79-84.

[23] Sun Z, Fu P, Wu W,et al.Identification of novel immunogenic proteins from Mycoplasma bovis and establishment of an indirect ELISA based on recombinant E1 beta subunit of the pyruvate dehydrogenase complex[J]. PLoS One, 2014,9(2)： e88328.

[24] Fu P, Sun Z, Wu W,et al. Development of a direct competitive ELISA for the detection of Mycoplasma bovis infection based on a monoclonal antibody of P48 protein[J]. BMC Vet Res, 2014,10：42.

[25] Khan FA, Faisal M, Guo A ,et al.Immunoproteomic identification of MbovP579, a promising diagnostic biomarker for serological detection of Mycoplasma bovis infection[J].Oncotarget, 2016,7：39376-39395.

[26] Kovrigina AM.Immunohistochemical technique in hemopathology： the ways of improving differential diagnosis and the prospects[J]. Arkh Patol, 2009,71(4)：18-23.

[27] Gagea MI, Bateman KG, Caswell JL, et al. Naturally occurring Mycoplasma bovis-associated pneumonia and polyarthritis in feedlot beef calves[J]. J Vet Diagn Invest, 2006,18(1)：29-40.

[28] Haines DM, Moline KM, Doig PA,et al.Immunohistochemical study of Hemophilus somnus, Mycoplasma bovis, Mannheimia hemolytica, and bovine viral diarrhea virus in death losses due to myocarditis in feedlot cattle[J]. Can Vet J, 2004,45(3)：231-234.

[29] Higuchi H, Iwano H, Nagahata H, et al. A simplified PCR assay for fast and easy mycoplasma mastitis screening in dairy cattle[J]. J Vet Sci, 2011,12(2)：191-193.

[30] Aebi M, Bodmer M, Pilo P,et al. Herd-specific strains of Mycoplasma bovis in outbreaks of mycoplasmal mastitis and pneumonia[J]. Vet Microbiol,2012,157：363-368.

[31] Murai K, Lehenbauer TW, Aly SS, et al. Cost-effectiveness of diagnostic strategies using quantitative real-time PCR and bacterial culture to identify contagious mastitis cases in large dairy herds[J]. Prev Vet Med, 2014,113(4)：522-535.

[32] Pinho, L., Thompson, G., Carvalheira, J., et al. Management practices associated with the bulk tank milk prevalence of Mycoplasma spp. in dairy herds in Northwestern Portugal[J]. Prev Vet. Med, 2013,108： 21-27.

[33] Nielsen PK, Petersen MB, Toft N, et al. Latent class analysis of bulk tank milk PCR and ELISA testing for herd level diagnosis of Mycoplasma bovis[J]. Prev Vet Med, 2015,121(3-4)：338-342.

[34] Bashiruddin JB, Frey J, Sachse K ,et al. Evaluation of PCR systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis： a collaborative trial[J]. Vet J,2005,169(2)：268-275.

[35] Ajitkumar P, Barkema HW, De Buck J. Rapid identification of bovine mastitis pathogens by high-resolution melt analysis of 16S rDNA sequences[J]. Vet Microbiol, 2012,155(2-4)：332-340.

[36] Rossetti BC, Frey J, Pilo P. Direct detection of Mycoplasma bovis in milk and tissue samples by real-time PCR[J]. Mol Cell Probes, 2010,24：321-323.

[37] Notomi T, Okayama H, Hase T,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2000,28：63.

[38] Bai, Z., Shi, L., Guo, A., et al. Development of a loopmediatedisothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Mycoplasma bovis[J]. Afr. J. Biotechnol, 2011,10：12333-12338.

[39] Higa Y, Uemura R, Sueyoshi M,et al. An improved loopmediated isothermal amplification assay for the detection of Mycoplasma bovis[J]. J Vet Med Sci, 2016,78(8)：1343-1346.

Research on Diagnostic Techniques of Mycoplasma bovis Associated Diseases

DONG Ya-qi1,3, ZHU Xi-fang2,3, LI Cheng1,3, CHEN Ying-yu2,3, SUO LANG Si-zhu1, GUO Ai-zhen2,3
(1.College of Animal Science and Technology, Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet, Linzhi 860000; 2.The State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070; 3.College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070)

In recent years, Mycoplasma bovis (M.bovis) associated disease is continuously a great threat to beef and dairy cattle industry in the world. The rapid and accurate diagnostic techniques have been paid much attention in the control of this disease and minimize economic losses. With research making progress on Mycoplasma bovis detection, novel techniques are increasingly developed. In this study, based on the epidemiology, clinical symptons, bacteriology, immunology and molecular biology methods, we summarizes the diagnosis technology of M. bovis infectionn order to provide a reference to treatment and control of M.bovis associated diseases.

Mycoplasma bovis; Diagnosis; Mycoplasma; Pneumonia; Mastitis

S858.23

A

1004-4264（2017）08-0036-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.08.009

2016-10-27

现代农业（肉牛、牦牛）产业技术体系专项经费（CARS-38）；国家自然科学基金面上项目（31272587）。

董亚旗（1990-），男，硕士研究生。

郭爱珍（1965-），女，教授，主要从事兽医传染病防控理论和技术研究工作。