同型半胱氨酸对大鼠心肌微血管内皮细胞线粒体功能的影响及通心络的保护作用

孙永辉 位 庚 贾振华 常丽萍

(河北以岭医院，河北 石家庄 050091)

同型半胱氨酸对大鼠心肌微血管内皮细胞线粒体功能的影响及通心络的保护作用

孙永辉1,2,3位 庚1,2,4贾振华1,2,3常丽萍1,2,3

(河北以岭医院，河北 石家庄 050091)

目的探讨通心络(TXL)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导大鼠心肌微血管内皮细胞线粒体功能损伤的保护作用及机制。方法用Hcy建立大鼠心肌微血管内皮细胞损伤模型，分为对照组、Hcy组、TXL-L组、TXL-M组、TXL-H组。分别检测各组细胞线粒体活性、线粒体膜电位(MMP)和细胞内活性氧(ROS)水平。结果与对照组相比，模型组细胞线粒体活性和MMP降低，细胞内ROS水平升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，TXL各浓度组均能不同程度地改善上述指标变化(P<0.05，P<0.01)。结论TXL能够改善Hcy诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞线粒体功能障碍，其作用机制可能与降低细胞内ROS水平有关。

通心络；心肌微血管内皮细胞；同型半胱氨酸；线粒体；活性氧

线粒体是细胞内重要的细胞器，存在于大多数真核细胞中，不仅可以调节细胞的能量代谢，还可以调控细胞的坏死和凋亡，并参与细胞的信号转导。近年研究发现，血管内皮细胞线粒体功能障碍在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用〔1〕。中药复方制剂通心络(TXL)在脉络学说指导下研制而成，对心血管疾病的防治疗效显著〔2〕，对血管内皮细胞具有明显的保护作用。本研究选用同型半胱氨酸(Hcy)为诱导因素，损伤原代提取的大鼠心肌微血管内皮细胞(RCMECs)，探讨TXL对血管内皮细胞线粒体功能的保护作用及其可能机制，为TXL防治心脑血管疾病提供实验数据支持。

1 材料与方法

1.1动物 2周龄SPF级SD雄性大鼠10只，体重(30±5)g，由北京富豪实验动物养殖中心提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。

1.2药物及试剂 TXL由石家庄以岭药业股份有限公司提供；ECM培养基套装(美国Sciencell公司)；CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所)；活性氧(ROS)测试盒(南京建成生物工程研究所)；CD31抗体和DyLight®488标记的羊抗小鼠IgG抗体(美国Abcam公司)；JC-1线粒体膜电位分析试剂盒(美国Cayman公司)。

1.3仪器 PrimoVert倒置显微镜(德国Zeiss公司)；多功能酶标仪(美国Bio Tek公司)；FACSAriaⅢ超速流式细胞分选系统(美国BD公司)。

1.4方法

1.4.1药物配制 称取TXL药粉适量溶于无血清ECM培养基，超声促溶20 min，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，用0.22 μm无菌微孔滤器过滤除菌，将所得沉淀于60℃加热烘干，计算实际溶于无血清ECM培养基中的药物重量，制备成10 mg/ml TXL贮存液，分装后-20℃贮存备用。

1.4.2RCMECs的分离、培养和鉴定 参照文献〔3〕并加以改进，分离、培养和鉴定RCMECs。提取的原代RCMECs经CD31免疫荧光鉴定显示纯度大于95%。

1.4.3细胞分组及处理 将RCMECs随机分为：①对照组(Control)：细胞正常培养；②Hcy组：培养液含10 mmol/L Hcy；③TXL低浓度组(TXL-L)：培养液含Hcy 10 mmol/L和TXL 100 mg/L；④TXL中浓度组(TXL-M)：培养液含Hcy 10 mmol/L和TXL 200 mg/L；⑤TXL高浓度组(TXL-H)：培养液含Hcy 10 mmol/L和TXL 400 mg/L。

1.4.4CCK-8法检测RCMECs线粒体活性 取对数生长期的RCMECs以1.0×108L-1的细胞浓度接种于96孔培养板中，每组3个复孔，每孔加入100 μl细胞悬液培养24 h后用于实验。按照“1.4.3”所示处理后，于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育24 h，吸弃培养基，加入含有CCK-8的无血清培养基100 μl(CCK-8溶液∶无血清培养基=1∶10)，37℃、5%CO2培养箱中继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长处OD值。以Control组OD值作为参照，以各组OD值与Control组OD值的比值进行统计分析。

1.4.5JC-1试剂测定细胞中线粒体膜电位 接种于96孔细胞培养板的RCMECs按“1.4.3”处理结束后，于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育24 h，用JC-1试剂测定细胞中线粒体膜电位，实验操作步骤严格按说明书进行。

1.4.6流式细胞仪检测细中ROS水平 RCMECs按“1.4.3”处理24 h后弃去上清，PBS清洗细胞2次，加入含DCFH-DA(1∶10 000)的ECM无血清培养基，37℃、5% CO2培养箱中继续孵育30 min，0.25%的胰酶消化2 min，加入ECM培养基使细胞终止消化，轻轻吹打制成细胞悬液，移入1.5 ml无菌EP管中1 000 r/min离心5 min后弃上清收集细胞，PBS洗涤细胞2次后移至流式管中，用流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1各组RCMECs线粒体活性比较 与Control组〔(100.00±4.48)%〕比较，Hcy组细胞线粒体活性降低〔(71.65±3.82)%〕(P<0.01)；与Hcy组比较，TXL-H组细胞线粒体活性升高〔(91.72±6.90)%〕(P<0.01)；与TXL-L组〔(77.29±2.35)%〕比较，TXL-H组细胞线粒体活性升高(P<0.05)；与TXL-M组〔(80.12±8.47)%〕比较，TXL-H组细胞线粒体活性升高(P<0.05)。

2.2各组大鼠心肌微血管内皮细胞线粒体膜电位比较 与Control组(3.62±0.15)比较，Hcy组细胞线粒体膜电位降低(2.00±0.14)(P<0.01)；与Hcy组比较，TXL-M组(2.52±0.23)和TXL-H组(2.89±0.19)细胞线粒体膜电位升高(P<0.01)；与TXL-L组(2.21±0.02)比较，TXL-M组和TXL-H组细胞线粒体膜电位升高(P<0.05或P<0.01)；与TXL-M组比较，TXL-H组细胞线粒体膜电位升高(P<0.05)。

2.3各组大鼠心肌微血管内皮细胞活性氧水平比较 与Control组〔(19.83±2.97)%〕比较，Hcy组细胞ROS水平〔(38.17±10.28)%〕升高(P<0.05)；与Hcy组比较，TXL-H组细胞ROS水平〔(22.50±3.66)%〕降低(P<0.05)。TXL-L、TXL-M组ROS水平分别为(33.83±9.41)%、(30.90±9.83)%。

3 讨 论

高Hcy血症已成为心脑血管疾病的独立危险因素〔4〕。现代研究发现，Hcy可引起血管内皮细胞损伤〔5〕，诱发线粒体功能障碍〔6〕。心肌微血管位于循环系统的末梢，由单层内皮细胞和基膜组成，决定心肌灌注水平，在一定程度上影响冠脉储备。在血管性疾病的发生过程中，微血管病变的发生同时或早于其供养的大血管〔7〕，所以微血管内皮细胞在心脑血管发病中的作用逐渐受到人们的重视。“络以通为用”为脉络病变的总体治疗原则，TXL是在中医络病理论指导下，结合气血相关理论组方而成，由人参、赤芍、降香、全蝎、水蛭、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、檀香、酸枣仁、乳香及冰片组成，具有化瘀通络、益气活血等功效。大量实验已证实，TXL不但具有保护血液的作用(抗炎、降脂、减少阿司匹林抵抗)，而且具有保护血管的作用(抑制不稳定斑块、保护血管内皮细胞、抑制内皮细胞凋亡、解除痉挛)，同时其具有保护心脑血管组织等作用〔8～10〕，临床研究亦证实其在防治有一定的作用〔11～13〕。

线粒体存在于大多数细胞中，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，对细胞受到的损伤较为敏感。氧化应激、再灌注损伤和Ca2+超载等多种细胞死亡信号的刺激可使横跨线粒体内、外膜的线粒体通透性转换孔保持持续开放，通透性增加，使线粒体膜电位下降，导致跨膜的氢离子浓度梯度消失，引起呼吸链脱耦联，此时线粒体发生渗透性水肿，外膜破裂，使存在于线粒体内的CytC释放入胞质〔14〕，导致线粒体内的CytC减少，直接造成了线粒体内呼吸链电子传递的中断，抑制氧化磷酸化，促进了氧自由基的生成，继而ATP含量减少，可最终导致细胞损伤乃至坏死〔15〕。本研究表明，Hcy可引起RCMECs线粒体活性降低，而TXL高剂量组可有效抑制细胞线粒体活性下降；并且TXL可有效逆转线粒体的损伤状态。ROS是氧元素在体内氧化还原反应的产物，其表达量过多导致的氧化应激可直接导致血管内皮细胞氧化损伤和功能障碍，ROS还作为信号分子放大和叠加损伤作用〔16，17〕，线粒体不仅是ROS产生的主要位点，更是ROS损伤的主要靶点。本研究显示，Hcy诱导细胞损伤后，伴随细胞线粒体功能的损伤，细胞内ROS水平也明显升高，TXL高剂量干预后，细胞内ROS水平明显降低，细胞线粒体功能也随之改善。

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3位 庚，李红蓉，刘红利，等.通心络对大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2016；36(6)：709-17.

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〔2016-08-12修回〕

(编辑 郭 菁)

EffectofTongxinluoonhomocysteine-inducedratcardiacmicrovascularendothelialcellsmitochondrialdysfunction

SUNYong-Hui，WEIGeng，JIAZhen-Hua,etal.

YilingHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050091，Hebei,China

ObjectiveTo observe the protective effects of Tongxinluo(TXL) on homocysteine(Hcy)-induced rat cardiac microvascular endothelial cells (RCMECs) mitochondrial dysfunction, and to determine the mechanism behind its protection.MethodsHcy was used to develop model, the cells were divided into control, Hcy, Tongxinluo low, middle and high groups. The cell mitochondrial activity, mitochondrial membrane potential (MMP), content of adenosine triphosphate(ATP), reactive oxygen species(ROS)level and protein expression of Cytochrome C (Cyt C)were observed.ResultsCompared with those of Control group, cell mitochondrial activity, MMP and ATP concentration were decreased in Hcy group, ROS production and protein expression of Cyt C were increased in Hcy group(P<0.05，P<0.01). Compared with those of Hcy group, the index of different changes of TXL every dose group were improved, and the high concentration of tongxinluo group was the best(P<0.05，P<0.01).ConclusionsTXL could improve Hcy-induced dysfunction of mitochondria in rat cardiac microvascular endothelial cells, and plays a protective role by reducing ROS level in the cells.

Tongxinluo；Cardiac microvascular endothelial cells；Homocysteine；Mitochondria；Reactive oxygen species

R285.5

A

1005-9202(2017)18-4435-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.003

国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2012CB518606)

1 络病研究与创新中药国家重点实验室

2 国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)

3 河北省络病重点实验室 4 石家庄市第二医院

位 庚(1980-)，女，博士，主治医师，主要从事心血管疾病的研究。

孙永辉(1979-)，男，硕士，主治医师，主要从事心血管疾病的研究。