副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法综述

魏 凤，张文通，李 峰，沈志强,

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法综述

魏 凤1，张文通2，李 峰1，沈志强1,2

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

副猪嗜血杆菌病是引起呼吸系统疾病的重要传染病之一，严重危害养猪业健康发展。正确诊断副猪嗜血杆菌病对防治该病极为关键。本文就该病病原分离鉴定、血清学诊断、分子生物学诊断三方面展开阐述，以期弄清该病诊断方面的研究进展。

副猪嗜血杆菌；诊断方法；综述

副猪嗜血杆菌病（HPS）是猪的一种传染性病症，以呼吸困难、多发性浆膜炎和关节炎为主要特征。该病主要影响2周龄到4月龄的青年猪。感染猪群主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率达20%～30%，严重时死亡率可达50%以上。该病随着养猪集约化发展，再加上免疫抑制病（如猪圆环病毒2型病毒病、猪繁殖与呼吸综合征等），目前在我国流行日趋严重[1-3]。预防该病所用的疫苗由于血清型之间的差异，交叉保护率低，给养猪业带来严重的损失，已成为影响养猪业最重要细菌性疾病之一。

防治该病的关键措施之一是对该病病原的确诊。依靠对发病猪群的病史、临床症状、剖检病变这些传统诊断方法可以进行初步诊断，但弄清病原乃至病原的血清型必须依靠实验室诊断。自1922年Schermer和Ehrlich分离出该病原以来，科研工作者对该病确诊进行了大量的研究，取得了显著成绩。本文就该病实验室诊断方法的研究进展进行了如下综述。

1 细菌分离鉴定

细菌的分离培养对确诊是十分有必要的，但往往因杂菌的干扰而不能分离成功。

细菌分离鉴定时应当采集处于疾病急性期的猪并且没有使用抗生素的病料，无菌操作条件下采集病猪肺脏、关节液、淋巴结等组织，通常在接种于含NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的巧克力琼脂平板。在含血清和NAD的TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）培养基培养48 h后，可以观察到针尖大小、圆形、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的菌落。革兰氏染色后显微镜下观察，为革兰氏阴性细小杆菌。在无菌操作条件下，挑取上述可疑菌落，水平划线接种于无 NAD 的绵羊鲜血平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37 ℃培养 24～48 h后，观察其在葡萄球菌周围生长情况，应出现“卫星生长现象”且无溶血现象[3-4]。

2 血清学诊断

副猪嗜血杆菌病血清学的诊断方法主要包括补体结合试验(CF)，平板凝集试验、间接血凝试验(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)。

补体结合试验，用补体结合试验方法检测副猪嗜血杆菌的抗体，发现在补体结合试验中各种血清型之间具有广泛的交叉反应性。

高艳等利用副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制备血清抗体，建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。

魏子贡等用超声波破碎的副猪嗜血杆菌血清4型和血清5型抗原代替副猪嗜血杆菌煮沸物或热酚水透析物，用醛化鞣酸化的绵羊红细胞代替新鲜绵羊红细胞，经对免疫猪群的抗体水平检测，免疫猪群2周后抗体检出率达89%；对1 665份猪血清进行检测，阳性率为47.1%。该方法敏感性较高，特异性强、重复性好，可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查。石碧等建立了用荚膜多糖作为包被抗原的间接血凝方法，通过优化荚膜最佳生长条件，得到了高质量的抗原，从而使抗体检测的敏感性得到了大大的提高。而Miniats等曾用副猪嗜血杆菌0322株盐水浸出抗原致敏绵羊红细胞检测阳性血清，结果表明IHA法与间接ELISA检测法符合率为65.3%。

李鹏等利用纯化融合P2蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件，建立了可检测抗HPS P2蛋白抗体的间接ELISA方法，并用所建立的P2-ELISA与国外进口的HPS检测试剂盒Synbiocits-ELISA对196份临床送检血清进行平行检测，阳性符合率为93.4%。臧莹安等利用副猪嗜血杆菌OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白，建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的间接ELISA抗体检测方法， 通过对进行和未进行 HPS免疫的健康猪血清的检测，证实了建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点，可用于HPS的快速诊断。郑念广等采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白，混合作为包被抗原，建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。结果表明敏感性比间接血凝试验高与国外ELISA试剂盒一致，可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。冯小明等采用超声裂解的副猪嗜血杆菌菌体上清作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。建立的间接ELISA方法的特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查 。

3 分子生物学检测

在动物传染性疾病的诊断研究中，分子生物学方法的引入，大大提高了诊断结果的准确性，特别是对一些生长缓慢的病原体所致的疾病的诊断的发展。

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计的引物建立的PCR诊断方法可以从临床样品中检测出副猪嗜血杆菌，这种方法检测的最小细菌浓度为102CFU/mL，其敏感性也远远高于常规的细菌分离方法。刘建奎等针对副猪嗜血杆菌16 S rRNA序列设计1对特异性引物，并据此建立了快速准确鉴定副猪嗜血杆菌PCR方法，13份疑似病料检测结果表明，PCR检测结果与传统生化鉴定结果符合率为100%。

车勇良等建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增（LAMP）方法。是常规PCR检测最低限的100倍，显示出较高的敏感性。

2013年，李富祥等根据副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了副猪嗜血杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该方法最低可检测到6.92×101copies/μL的标准品阳性质粒；临床样品检测结果表明，该方法可用于副猪嗜血杆菌感染的早期诊断和流行病学调查以及副猪嗜血杆菌的定量分析。罗宝正等参考 GenBank 已发表的副猪嗜血杆菌转录起始因子infB基因序列设计特异性引物和探针，建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法。结果表明 TaqMan 探针荧光 PCR 方法和细菌分离方法的检测效果一致。

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2017-03-17）

山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目 SDAIT-08-17

魏凤，女（1979-），河南遂平人，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究，E-mail：hzndzwt1@163.com