酶联免疫吸附法在口蹄疫诊断中的研究进展

（重庆市六九畜牧科技股份有限公司）

酶联免疫吸附法在口蹄疫诊断中的研究进展

张 亮

（重庆市六九畜牧科技股份有限公司）

口蹄疫属于我国一类动物疫病，防治该病的关键是做出及时、准确的诊断。本文介绍了ELISA方法在口蹄疫诊断中的应用研究进展，传统ELISA方法包括液相阻断ELISA、间接ELISA、固相竞争ELISA、间接夹心ELISA；新型ELISA方法包括单克隆抗体ELISA、PCR-ELISA、生物素-亲和素ELISA及Dot-ELISA。随着技术的进步及养殖领域的规模化，ELISA 在临床诊断和流行病学调查中将会有更加广泛的应用。

口蹄疫；诊断方法；酶联免疫吸附试验

口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。该病发病率极高，对畜牧业生产及国际贸易影响严重，因而备受重视。酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理是将抗原或者抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，通过底物显色后用肉眼或者分光光度计判定结果。作为一种新的免疫诊断技术，ELISA自20世纪70年代初问世以来发展十分迅速，被广泛用于生物学和医学的各个领域。

1 传统ELISA检测FMDV

1.1 液相阻断ELISA

Hamblin等[1]于1986年以病毒中和试验（VNT）和液相ELISA实验原理建立了用于检测FMD抗体的液相阻断ELISA，并做了液相阻断ELISA与VNT的比较试验，结果显示相关系数在0.8以上，属高度相关。

液相ELISA与VNT比较，最大的优点就是使用灭活的抗原，无需担心散毒，也使FMD的诊断从实验室走向了普通养殖场。液相阻断ELISA主要应用于2个方面：1)检测FMD病毒感染；2)检测免疫抗体，评价FMD疫苗免疫效力，这也体现出疫苗免疫动物后该动物抵抗强毒的攻击能力。不足的是该方法检测结果可能会出现一定的假阳性。

1.2 间接ELISA

间接ELISA方法是以口蹄疫病毒蛋白为包被抗原，用来检测动物血清样品中的抗体水平，可用于鉴别感染动物和疫苗免疫动物。与其他ELISA的区别在于直接将病毒抗原包被于板上，简单易操作，且具有较高的敏感性。2003年朱彩珠等[2]利用非结构蛋白建立了间接ELISA方法，用于区分FMDV感染动物和疫苗免疫动物，试验结果证明，该ELISA方法的灵敏度比病毒感染相关抗原琼脂糖凝胶免疫扩散试验高。2010年张润祥等[3]建立了牛口蹄疫抗体的检测方法，重复性试验表明，批内批间变异系数均小于10%，检测非免疫无口蹄疫国家的牛阴性血清的特异性为100%；检测感染血清敏感性为97.3%；检测O-AsiaⅠ二价苗免疫牛血清，与4种商品化试剂盒比较，其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%，符合率较高，说明这种ELISA有良好的应用价值。

1.3 间接夹心ELISA

间接夹心ELISA用于检测大分子抗原，它不仅不必标记每种抗体，还可提高实验的敏感性。该方法与补体结合试验相比，前者的敏感性远大于后者，并且克服了补体结合试验样品定型率低的缺点。对于含毒量较高的样品，如新鲜的水泡皮和细胞培养物可在2～4 h内获得结果，如使用预先在实验室包被的免疫反应板及冻干剂，将更便于现场检测。在国内，2007年吴国华等[4]进一步发展了间接夹心ELISA，建立了口蹄疫O，A，Asia I各血清型间接夹心ELISA方法，检验证明该方法具有良好的特异性和敏感性，批内重复变异系数在10%以下，具有很好的重复性，并且该ELISA诊断方法可应用于口蹄疫病毒的定型诊断。

间接夹心ELISA用灭活的沉降系数为146s的完整FMDV粒子制备抗血清或作抗原，既可在一般实验室操作，也可制成试剂盒用于农场检测。该法可根据检测目的不同用双抗夹心法及其变法进行病毒抗原的检测，也可用阻断夹心法等测定血清中的病毒抗体。

1.4 固相竞争ELISA

固相竞争ELISA法除具有液相阻断ELISA的优点外，还具备特异性更高、操作更为简便、结果更稳定等特点。但固相竞争ELISA由于需要大量的洗涤过程，减缓了样品的检测速度，所以在疾病暴发期间不能对大量的样品进行快速的检侧。

2008年林密等[5]建立了O型FMDV固相竞争ELISA抗体检测方法，并确立了O型FMDV固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型FMD血清阳性判定标准：抗体效价大于或等于1∶32时判为O型FMD抗体阳性；1∶16至1∶32时判为O型FMD抗体可疑。

2 新型ELISA检测FMDV

2.1 生物素－亲和素ELISA

亲和素和生物素结合特异性与亲和力都很强，两者一经结合就极为稳定。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联可大幅提高ELISA的敏感性。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，也可用于终反应放大，还可在固相载体上预先包被亲和素，然后把抗原或抗体与生物素结合，通过生物素-亲和素反应使抗原或抗体吸附于固相载体，这种包被法不仅可增加吸附抗原或者抗体量，而且可以使其结合位点充分暴露。

1992年Sorensen等[6]建立了可检测FMDV SAT1、SAT2和SAT3血清抗体的阻断ELISA方法，在这个方法中使用了生物素－亲和素系统。他们用此方法与世界参考实验室的液相ELISA方法进行了比较，结果证实该方法具有高特异性和灵敏性，可作为抗体水平评估的一种精确可行的方法。

2.2 单克隆抗体ELISA

单克隆抗体（McAb）具有高度均质性和高度特异性，是检测抗原位点的最佳分子探针，而ELISA对结果判断比较客观，敏感性和特异性比较高，因此近年来很多学者试图通过结合两者的优点来大幅提高ELISA检测方法的准确性。他们建立的方法有直接用纯化抗原包被酶标板用于检测待测血清，也有基于单克隆抗体的间接捕获ELISA、竞争ELISA方法，均具有敏感性高、重复性好、结果判定准确的特点。

2009年Morioka等[7]以单克隆抗体建立了直接夹心ELISA（SMDELISA），这种ELISA能从临床样品（血浆和唾液）中检出FMDV抗原，阴性检出率很低。其结果与RT-PCR检测结果高度一致，并且这种夹心ELISA对于每一个稀释度的血清型抗原检测结果都显示了比世界动物卫生组织推荐使用的间接夹心ELISA方法具有更高的光吸收度，显示出其有极高的敏感性。

很多实验室为提高感染动物和疫苗免疫动物的区分率，开发出了FMDV非结构蛋白和单克隆抗体相结合的ELISA。FMDV非结构蛋白2C[8]，3A[9]，3B[10]，3D[11]的单克隆抗体已经被成功制备，李永亮等[10]用3B单克隆抗体建立了液相阻断ELISA方法，该方法能特异、敏感地检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分，并能进行定量。相信在不久的将来，2C、3A、3D单克隆抗体也会应用到口蹄疫的ELISA当中。

2.3 RT-PCR ELISA

RT-PCR ELISA是将PCR技术与ELISA相结合的一种抗原检测技术，又称免疫PCR。该方法的特点是利用PCR反应的指数级扩增效应带来极高的敏感性，同时又具有高特异性的抗原检测系统。其原理是用生物素标记寡核苷酸探针，用链霉亲和素包裹微孔反应板，封闭后加入生物素标记的探针与之结合，样本经PCR扩增（在PCR缓冲液中加入一定比例的地高辛标记的dUTP）后，扩增产物与生物素标记探针进行液相杂交，然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗地高辛抗体，加入底物显色，进行ELISA检测。

Barlic-Maganja等[12]建立了一种RT-PCR ELISA用来检测FMDV，RT-PCR在免疫检测单孔杂交试验中放大产品。

RT-PCR ELISA具有高灵敏度、检测结果可靠、可进行半定量检测等优点，可用于病毒检测、疾病诊断和目的基因的检测。与抗原ELISA相比，RTPCR ELISA方法可以对体积小但数量巨大的口蹄疫病毒灭活材料进行检测。

2.4 Dot-ELISA

Dot-ELISA的基本原理与常规ELISA一样，即将抗原或抗体包被于纤维素膜上，经膜的吸附和富集作用，通过与相应酶标抗体或酶标抗原形成标记抗原抗体复合物，再经酶促反应使底物变色，最后以纤维素膜上斑点的有无及色泽深浅来判定结果。由于滤膜载体具有对蛋白质进行吸附、吸收水分、浓缩聚集等作用，所以尽管包被用的抗原或抗体量少，但膜上中心点单位面积的抗原或抗体浓度远远高于常规ELISA，从而大大提高了敏感性。并且Dot-ELISA可以作为区分自然感染和疫苗免疫动物的有效方法

利用生物素-亲和素系统生物放大作用而建立的ABC-Dot-ELISA更进一步提高了Dot-ELISA的敏感性。杨永钦等[13]研制出用于检测FMDV的ABCDot-ELISA试验方法，用光敏素标记的纯化A蛋白(SPA)代替第二抗体，通过碱性磷酸酶(AP)标记的亲和素检测生物素化抗体，最后加底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)和四氯唑蓝(NBT)显色判定，该法具有良好的重复性和特异性，样品用量少，不需特殊仪器、缩短检测时间等特点。由于引入生物素系统和AP，使灵敏度大大提高，能检出微量抗体，比常规ELISA更为敏感。

3 总结与展望

ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、廉价、快速、稳定且易于实现自动化操作等优点，因此不仅适用于大量临床标本的检测，也适合血清流行病学调查，目前在国内许多中型养殖场即配备，使用范围广。另外ELISA还有一个显著的优点：既可以用来检测抗原，也可以用于检测抗体。而在检测抗体中避免了对活病毒的操作，非常适合在普通实验室使用。

现在研究人员正在不断地优化反应条件，简化实验步骤，使ELISA更灵敏稳定而又操作方便，有报道[14]一种同源分析的新型ELISA也许会应用于诊断FMD的血清学试验中，这种新型ELISA不需要洗板，因此比传统的ELISA方法更适合于机器操作，如果这种方法得到推广，不仅节省人力、大大加快检测速度，而且减少了人工操作产生的误差。可以预见，ELISA检测技术在临床诊断和流行病学调查中将会得到更为广泛的应用。

[1] HAMBLIN C, BARNETT I T.HEDGER R S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against footand-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA[J]. J Immunol Methods, 1986. 93(1)﹕115-21.

[2] 朱彩珠，张强，常惠芸，等.NSP-ELISA 鉴别FMDV 感染与免疫[J].中国兽医科技,2003,33(8)﹕ 3-6.

[3] 张润祥，高明春，曲哲会，等.牛口蹄疫病毒VP2 结构蛋白抗体间接ELISA 方法的建立[J].中国预防兽医学报,2010,32(2)﹕121-125.

[4] 吴国华，张强，颜新敏，等.口蹄疫定型ELISA 诊断方法的建立[J].中国兽医科学,2007,37﹕ 603-604.

[5] 林密，马军武，祁淑芸，等.O 型口蹄疫病毒固相竞争ELISA 抗体检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2008,30(8)﹕ 627-630.

[6] SORENSEN K J, MADEKUROZWA R L.DAWE P. Foot-and-mouth disease﹕ detection of antibodies in cattle sera by blocking ELISA[J]. Vet Microbiol, 1992. 32(3-4)﹕253-65.

[7] MORIOKA K, FUKAI K, YOSHIDA K, et al. Foot-and-mouth disease virus antigen detection enzyme-linked immunosorbent assay using multiserotype-reactive monoclonal antibodies[J]. J Clin Microbiol,2009.47(11)﹕3663-8.

[8] 田美娜，李永亮，付元芳，等.口蹄疫病毒非结构蛋白2c主要表位区的原核表达及其单克隆抗体的制备[J].中国预防兽医学报,2009,31(1)﹕69-73.

[9] 刘丹丹，高明春，宋军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3AB单克隆抗体的制备及其对应表位区分析[J].中国预防兽医学报，2011，33(9)﹕733-737.

[10] 李永亮，田美娜，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定[J].江苏农业学报,2009,25(2)﹕ 296-300.

[11] 田美娜，李永亮，卢曾军，等.口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志,2009,25(7)﹕ 625-627.

[12] BARLIC-MAGANJA D, GROM J, TOPLAK I, et al. Detection of foot and mouth disease virus by RT-PCR and microplate hydridization assay using inactivated viral antigens[J]. Vet Res Commun, 2004. 28(2)﹕149-58.

[13] 杨永钦，吴家骥.用生物素-亲和素强化免疫斑点试验检测口蹄疫病毒的研究[J].中国畜禽传染病,1994,77(4)﹕ 19-21.

[14] 闫海滨，赵刚，朱江巍，等.口蹄疫诊断技术的研究进展[J].现代畜牧兽医,2010(4)﹕ 66-69.

2016-11-16）

张亮（1990-），男，重庆开州人，硕士，预防兽医学，主要从事药物代谢酶基因检测。