西藏八角莲活性成分合成基因调控机理的研究

普罗

(西藏自治区林业调查规划研究院， 拉萨 850000)

人类利用植物来防病治病已有几千年的历史，至今已有近13000种植物被当作药物来使用。伴随着全世界“回归自然”思潮的重新流行，药用植物和天然药物又受到了人们的青睐。药用植物的活性成分有的直接可以当作药物使用，有的活性成分虽然不能直接作为药物来使用，但是它们却可以作为化学合成的原料或结构改造的对象。进入90年代以后，在分子生物学研究技术和成果推动下，药用植物活性成分生物合成基因调控的研究取得了很大发展，一些结构复杂的药用植物活性成分生物合成途径及其基因调控的细节逐渐被阐明，并且有些活性成分的人工调控也已获得了初步的成效，显示出了本领域美好的发展前景[1]。所以，药用植物活性成分一直是药用植物学和药物学研究的重点和热点。

西藏八角莲(DysosmatsayuensisYing)又名鬼臼、九臼、八角盘、独角莲，为我国多型特有属，隶属小檗科(Berberidaceae)。第一批国家珍惜濒危保护植物名录中将其列为三级保护植物[2-3]，西藏自治区科技厅也将其列为三级珍惜濒危藏药植物。八角莲根茎具清热解毒之功效，常用于治疗痈疮疔毒、毒蛇咬伤等。有报道认为鬼臼毒素(Podophyllotoxin)是八角莲的主要成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，是合成VP-16、VM-26等抗癌药的原料[4]。鬼臼毒素是八角莲的主要药用有效成分。King和Sullivan报道鬼臼毒素具有类似秋水仙碱的作用之后，引起人们的普遍关注，并推进了一系列的医学、生物学和化学的研究，并最终证明鬼臼毒素具有抗癌活性[5]。但是由于西藏八角莲有效成分低和生长周期长，因此给临床使用和质量控制带来一定困难。利用生物技术来改良西藏八角莲品质和提高鬼臼毒素的含量，进行西藏八角莲活性成分基因调控的研究将使人们在今后有目的地调控药用植物活性成分的含量、提高药用植物的质量，实现药用植物活性成分的大量生产之目的。

1 克隆培养中活性成分生物合成途径

西藏八角莲活性成分生物合成是利用3H，13C或14C等同位素标记的化合物，直接喂饲西藏八角莲的植株或其培养细胞来进行的。通过同位素标记的化合物(可能的前体)喂饲八角莲的植株，结合现代光谱、质谱和核磁共振(NMR)等分析技术即可进行西藏八角莲克隆培养中活性成分生物合成途径的研究。其中，放射性高效液相色谱仪是必备的工具。通过放射性高效液相色谱分析喂饲同位素标记底物一段时间后的八角莲培养细胞的提取物，便可以获得所有带有放射性同位素掺入的峰的滞留时间和数量等信息，与已知的标准样品进行比对或把该成分收集并进行质谱和NMR鉴定，就可以确定有放射性同位素掺入的峰(该峰必须是仅含一个化合物的纯的峰)所代表的化合物的结构。

2 生物合成相关基因的克隆、分离及表达特性

西藏八角莲活性成分生物合成相关基因的克隆、分离及表达特性的研究是人们有目的地对有关活性成分进行人工调控的前提条件，具有十分重要的意义。

2.1 相关基因的克隆方法

基因克隆就是把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，建成新的重组DNA，然后送入受体细胞中进行繁殖的过程[6-7]。与植物其他基因的克隆方法一样，八角莲活性成分生物合成相关基因的克隆方法有如下两种。

2.1.1 cDNA基因克隆法

cDNA克隆时首先是通过逆转录酶的作用，使总poly(A)mRNA在逆转录酶的催化作用下生成双链互补DNA(cDNA)群体，把这些群体连接到适当的载体后再转化大肠杆菌寄主菌株的细胞，这样就构成了包含着所有基因编码序列cDNA基因文库。另外，也可采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法提取总RNA，经poly(dT)纤维素和色谱柱分离出mRNA，以poly(dT)为引物反转录合成双链cDNA，并将双链cDNA末断补平后与EcoRI接头连接，然后克隆到λ-ZAPⅡ载体的EcoRI位点上。最后，将构建好的载体进行体外包装，并用包装产物侵染宿主E.coliX L 1-blue MRF’菌株，这样就构建出一个含重组子的cDNA文库。

2.1.2 基因组DNA克隆法

基因组DNA克隆法首先将完整的植物基因组DNA用限制性内切酶或超声波等机械方法随机地切割成长短不一的DNA片段，然后将这些长短不一的DNA片段连接进相应的DNA载体中，最后将重组体DNA转化进感受态细胞或是转染宿主细胞，并在细胞内进行大量增殖，从而组成八角莲基因组的所有不同大小DNA片段的克隆群。

2.2 相关基因的分离

2.2.1 蛋白质序列起始分离法

这是用于基因分离的最“原始”的方法。此方法先要分离、纯化蛋白质，再根据分离、纯化出来的蛋白质上的一段多肽氨基酸序列设计并合成出与这段氨基酸序列相应的核苷酸序列，再将这段核苷酸片段作为分子探针，从染色体基因或cDNA文库中筛选、分离出相对应的基因。

2.2.2 基因序列同源克隆法

因为基因序列具有同源保守性，因此可以通过将从一种生物中分离获得的基因的保守区制作成分子探针，对八角莲中的同源基因进行分离。另外，通过基因序列保守区设计出数十个核苷酸长的PCR引物，然后用PCR扩增八角莲染色体DNA或cDNA，再将所获得的PCR产物标记成分子探针筛选基因组文库或cDNA文库，也可以获得所要分离基因的克隆。

2.2.3 数据库克隆法

数据库克隆(database cloning)是利用DNA自动测序仪测序法或手工测序法对cDNA克隆进行逐一测序，获得一些具有完整序列的cDNA(即全长cDNA)。据有关cDNA克隆的序列与基因库(genebank)中的有关基因进行同源性比较后，可初步判断该基因的性质。在将有关全长的cDNA构建成合适的表达载体后，用大肠杆菌或酵母等异源表达体系进行蛋白质的表达，最后用相应的底物完成对有关基因所编码的蛋白质的功能鉴定。

2.2.4 表达差异杂交分离法

基因的表达模式具有其特殊性，表达水平会根据不同的生长环境、组织或发育阶段而发生变化，差异杂交分离法便是利用了这一特殊性。表达差异杂交分离法，首先假设两个不同源材料分别为A和B，然后利用A源的mRNA建立cDNA基因库，再用A源和B源的mRNA的cDNA分别制备分子探针，分别杂交A源的cDNA基因库，筛选出与两个源探针杂交有差异的克隆。最后，利用所克隆的cDNA作探针，看与其杂交的mRNA模式是否与目的基因表达模式相一致，一样者即为所要克隆基因的cDNA。

2.2.5 mRNA差别显示分离法

由Liang和Pardee在1992年创建的mRNA差别显示(differential display)分离法是一种发现差异表达基因的分子生物学新技术，其主要是通过对不同细胞的mRNA进行比较，从而找出特异表达的基因。mRNA差别显示分离法通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分，并用DNA序列分析胶(6%～8% polyacrylamide gel)同步分离有关扩增产物来进行比较。在操作时，首先以5′-T(n)MN-3′(锚定引物，其中n=10～20，M=dA/dC/dG，N=dA/dC/dT/dG)为引物，将待比较的mRNA进行逆转录以得到单链cDNA。逆转录以后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR扩增，3′引物就是上述锚定引物，5′引物是10～13个碱基的随机引物。通过对12个3′锚定引物和25个5′随机引物的不同组合，可以在一定情况下分析出若干个不同的基因的表达，这样就基本上包括单个细胞所能表达的全部基因的数目。

2.2.6 表达文库分离法

将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞以构成cDNA表达文库。接着用已纯化的蛋白质制备的抗体，并用所制备的抗体从上述活性表达基因文库(gene expression cDNA library )中筛选出有关基因克隆。

2.3 相关基因表达特性

在一个合适的表达系统中，使西藏八角莲活性成分生物合成相关基因得到表达，来研究其表达特性和生物学功能，是西藏八角莲活性成分生物合成分子机理的重要研究内容。而基因的表达往往包括原植物或植物细胞本身中的表达和异源系统中的表达，两者都涉及对基因的转录和翻译状况进行研究。诺塞恩杂交(Northern blot)是对基因的转录状况进行研究的常用方法，而韦斯顿蛋白质杂交技术(Western blot)——蛋白质印迹法是对翻译状况进行研究的常用方法。

目前，药用植物活性成分生物合成相关基因的异源表达的系统有细菌和真菌两种。

2.3.1 细菌表达系统

药用植物活性成分生物合成相关基因在细菌中表达时,可选用大肠杆菌JM109、JM109(ED3)、DH5a、E.coliBL21(ED3)、E.coliBL21(ED3)/PlysS、E.coliXI1-Blue作为宿主菌。宿主菌的选择对真核基因的表达十分重要，因为真核基因在细菌中表达的外源蛋白质通常不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。除了要有理想的宿主菌外，还必须有合适的表达载体。有了合适的宿主菌和表达载体后，为了使基因在细胞中更加高效表达，常常还需要调整SD序列与AUG之间的距离，或用点突变的方法改变某些碱基，消除mRNA二级结构，提高翻译的完整性。还可以通过在真核基因下游插入重复性回文(RFP)序列或具有反转重复序列的DNA片段的方法，来提高有关外源基因的表达水平。有时甚至还通过诱导表达的方法，人为控制细菌的生长和真核基因的转录活性。

2.3.2 酵母表达系统

真菌中的酵母菌(Saccharomycescereuisia)是单细胞的真核生物，它是研究基因表达理想的真核生物之一。许多酵母菌株都可作为基因克隆的受体菌。当外源基因在酵母细胞中表达时，最好将外源基因在酵母启动子(如ADHI)控制下，能在酵母细胞中表达，但其表达水平往往低于其内源基因本身的表达水平。影响酵母菌中外源基因表达的因素很多。例如启动子和起始密码子ATG间的距离比正常情况下的距离小，邻近ATG密码子的碱基序列也与正常情况不同，有可能导致最后的翻译水平发生降低。

3 生物合成调控

通过对参与西藏八角莲活性成分生物合成酶的性质的分析和对相关基因异源表达酶活性和反应动力学的分析，可以确定哪些酶及其基因是该活性成分生物合成途径中的关键酶和关键基因，哪一个步骤是此生物合成途径中的限速步骤(committed step)。

3.1 西藏八角莲基因转化技术

利用转基因技术从基因水平上西藏八角莲活性成分生物合成进行人工调控，除了要先构建好目的的基因外，另一个重要的前提是必须建立理想的转化技术。植物基因的转化技术有农杆菌介导法、PEG诱导法、电激法、病毒载体法、质体(liposome)法、微注射法(microinjection)、基因枪法、DNA溶液直接共培养法、花粉转移法、花粉管通道、电泳法、激光穿孔法、超声波转移法等。对于药用植物来说，目前最常用的是农杆菌介导法。

药用植物基因转移中用到的农杆菌有两种：根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。前者通常能够在植物中诱导肿瘤的产生，后者则可以诱导毛状根的产生，两者作为今音转移的原理相近，都是由于它们体内有一种质粒(Ti或Ri质粒)，这种质粒中有一段能够整合到植物基因组中并得到表达的T-DNA。T-DNA区大小约为20kb，主要包含有控制茎、根分化的基因，冠瘿碱合成酶基因等。此外，T-DNA区两端各有一段长约25bp的末端重复序列，分别为右端序列(RB)和左端序列(LB)，其中右端序列对T-DNA整合到植物染色体上起着至关重要的作用。Ti质粒上的毒性区(Vir)上一系列基因则在T-DNA整合到植物染色体上的过程中起着帮助作用。

3.2 反义技术

反义核苷酸是相对于编码链(正义核苷酸)而言，是与正义链互补的一段核苷酸序列，它是一种核苷酸或其类似物。与正义核苷酸结合后，能够阻止其转录和翻译。反义RNA分子作为一种阻断或封闭特定基因表达的手段已被广泛地研究和应用。反义技术就是根据碱基互补原理，通过人工合成或者是生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或者是其化学修饰产物)，来抑制或封闭某些基因表达的技术。通过这一技术，可以将反义RNA片段引入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶的表达受到抑制，导致目的化合物的含量提高，而其他化合物的合成途径则受到阻抑。

3.3 双链RNA干扰技术

RNA参与生物体许多基本的生理生化活动，如基因的表达与调控。在多种生物中，存在内源性的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)或将外源性的双链RNA导入细胞中后，与dsRNA同源的mRNA则受到降解，因而其相对应的基因的表达受到抑制。

3.4 调节调控基因

通过控制八角莲活性成分生物合成基因的调节基因(如转录子)的表达来增加目的产物的含量。由于植物次生代谢的可塑性(plasticity)，通过对活性成分生物合成途径中的关键酶的基因进行人工调控，往往很难达到提高目的产物的目的。在这种情况下，可以通过对有关基因的调节基因进行调控来达到目的。

4 活性成分基因调控的开发前景

西藏具有丰富的野生植物资源，尤其是药用植物资源，其开发利用前景广阔。然而目前的开发利用仍处于原始状态，应用现代生物技术开发利用中草药是科学发展的必然。开发保健类中草药是开发利用的一个方面，对抗癌药物的探寻是开发利用的另一个重要方面，也是近年来制药工业界的热门话题。西藏八角莲为我国西藏所特有的小檗科植物，因其植物体内含有重要的抗癌(或抑癌)药物成分鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素(Deoxypodophyllotoxin)。对于治疗皮肤癌、宫颈癌有很大作用，另外其衍生物对乳癌、子宫癌、结肠癌有一定的治愈功效，具有重要的药用价值和开发利用前景。

由于西藏八角莲种群数量不多，分布区域较少，天然植物体内含有的有效的抗癌成分较少，另外，近年来，鬼臼毒素的需求量激增，人为破坏野生资源严重，采用原始方法从天然植物中提取的抗癌有效成分供不应求。通过新技术获得次生代谢产物含量相对较高而稳定的无性系，并且进行大量培养，从而获得鬼臼毒素及其衍生物具有重大意义。因此该项研究不仅奠定了工业化生产鬼臼毒素的基础，而且在保护珍稀植物、开发利用野生药用植物、发展生物制药工程、推进林业可持续发展和保护物种多样性等方面，具有重要的理论意义。另外，该项研究也具有重要的经济、生态效益，特别是对西藏藏药事业的发展具有重要意义。

综上所述，在过去的近十年里，药用植物活性成分基因调控的研究已经取得了不少进展。对植物次生代谢产物生物合成途径中的多个基因乃至所有基因同时进行研究，是次生代谢产物生物合成途径研究领域新的发展趋势，将有望从根本上揭示植物次生代谢产物生物合成调控的规律，研究道地药材品质形成的分子机理，达到人工调控道地药材品质的目的。相信在不久的将来，人们将会获得更多活性成分含量得到提高或活性成分之间的比例发生改变的转基因药用植物新品种，并将它们用于大田的栽培实践中，而且还有可能获得更多经基因工程技术改造的药用植物优良细胞系，并进行有关活性成分的大规模生产，使更多的药用植物细胞培养走向实用性和产业化，为广大人民的健康提供技术支撑和物质保证。

[1]高文远，贾伟.药用植物大规模组织培养[M].北京：化学工业出版社，2005．

[2] 傅立国.中国植物红皮书:稀有濒危植物:第一册[M].北京:科学出版社,1992.

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