全基因组关联分析在中医证候研究中的应用展望*

陈 刚，周 欣，薛文达，吴颢昕

(南京中医药大学基础医学院转化系统生物学与神经科学研究中心，中医脑病学重点实验室，南京 210023)

【综述】

全基因组关联分析在中医证候研究中的应用展望*

陈 刚，周 欣，薛文达，吴颢昕

(南京中医药大学基础医学院转化系统生物学与神经科学研究中心，中医脑病学重点实验室，南京 210023)

中医证候的科学本质是中医基础研究中的核心内容，也是揭开中医辨证论治个性化治疗奥秘的关键，但目前对其的认识仍然有限。通过介绍复杂性状遗传学的基本概念，提出将证候作为生命活动表现的复杂性状，运用复杂性状遗传学研究手段，特别是当前迅速发展的全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)方法，以解析证候个体化差异的分子遗传基础。除了进行人群的证候GWAS研究，还可利用遗传参照种群小鼠资源进行证候的分子及系统网络GWAS研究。故展望了在中医基础研究中利用模式动物建构合适的中医病-证模型进行GWAS研究的广阔前景，该方法的推广应用将在新的方向上推动中医基础研究的发展。

证候;复杂性状遗传学;全基因组关联分析;遗传参照种群小鼠;模型

中医的特色及优势在于整体观念和辨证论治，即在系统了解疾病与患者特点的基础上，通过望闻问切等手段辨识证候段，对证遣方用药。证候是生命活动的外在表现，体现出疾病病理的时空维度。证候本质的研究是中医学现代研究的核心，也是最有挑战性的领域，一定程度上是制约中医基础理论学科乃至整个中医学科现代发展的最主要因素［1］。揭示证候的生物学基础对确立证候科学内涵与阐明证候科学本质不可或缺。尽管经过多年的研究和探索，目前对证候的特点和机制有了一定的了解，但是由于病证机理复杂，特别是研究思想、方法与手段上的限制，对证候本质的认识仍然不够深入。

1 中医证候的特点及其复杂性

一般认为，证候既反映疾病在同一个体上的阶段性病理生理变化，具有鲜明的时相性特征;同一阶段内在不同人群中又有证候类型之别，反映出空间性特征。证候的差异性来自于遗传与环境共同作用，是遗传物质对生命活动生物整体层面的表现。这种表现可以像任何可测量的物理或生物化学特征一样进行分析，该分析方法通常被称为“表现型”或“表型”(phenotype)分析。理论上，所有个体间的某表型差异可以通过与基因型的差异性进行联系，以解析基因型如何参与决定该表型。因此，可以运用现代遗传学技术，以证候的相关表型为研究对象，鉴别与说明证候的分子遗传基础从而揭示其生物学本质。

证候的复杂性决定了其表型分析需要运用复杂性状遗传学(complex trait genetics)的方法［2］。在生物界，大多数疾病表型均是复杂性状，受多种基因(polygenic)及其与环境相互作用的影响，而不是简单地遵循孟德尔遗传，即单基因(质量性状)遗传。数量众多但是单个效果比较小的基因，及他们与环境的相互作用常常使表现型呈连续(数量)分布。因此，对此类性状的研究称为数量性状遗传学或复杂性状遗传学［3］。经典的孟德尔遗传学的观点认为，1种性状(trait)是由1种基因控制的，某种基因的缺陷足以导致特定的障碍［4］。但是人体大部分性状并不遵循孟德尔单基因遗传规律，如高血压［5］、青光眼［6］等疾病都表现为复杂性状。某种特定中医证候在人群个体间常常在程度或范围上有所差异，很少是全或者无这种典型的质量性状表现。由此，大部分中医证候都应归于复杂性状。

2 复杂性状遗传学研究方法及其在中医证候研究中的应用

复杂性状遗传学在研究方法上主要有两类。传统的复杂性状遗传学通过双生子、收养子家系研究来探索遗传对特定性状的贡献率［7］。几十年来的研究结果充分说明，遗传因素影响着几乎所有的复杂性状。遗传变异对许多复杂性状，如对行为影响的遗传度估计值大多在0.4～0.6之间［8］，也就是说，表现型变异的40%至60%是由遗传差异性决定的。已有研究者提出运用双生子研究中医证候［9］。通过家系的基因型连锁研究(linkage studies)方法［10］，可以筛查出影响特定性状的某个染色体区域，甚至可以精确定位影响该形状的特定基因。然而大多数复杂性状往往牵涉很多微效基因，单独的连锁研究很难鉴定这些微效基因。现在常通过结合基因组、基因表达、蛋白质相互作用等信息来帮助鉴别特定染色体片段内的候选基因［11］。这种方法被称为系统遗传学方法(systems genetics)［12］。另一种方法称为关联研究(association studies)［13］。该研究方法直接将性状的差异性与基因序列的差异性进行关联。如目前迅猛发展的全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)，应用基因组中数以百万计由单个核苷酸变异所引起的变异DNA序列为分子遗传标记，进行全基因组水平的对照分析或相关性分析，发现影响复杂性状的基因变异［14］。从2005年《科学》杂志报道了第1篇重要的GWAS研究论文，到现在10年的时间里，GWAS研究成果呈爆炸性增长，发现了许多影响不同疾病的基因。GWAS相对于连锁研究的优势是能直接鉴定影响特定表型的基因或DNA序列。此方法可以直接对证候、体质等不同中医表型与全基因组范围的遗传变异性直接关联，可作为解析影响中医证候分子基础的非常有力的工具。此分析不需要对所研究对象的机制作任何假设，这对中医证候研究特别重要而有用，因为许多证候产生的原因及其细胞和组织病位生理基础都不明确。目前证候的GWAS临床研究从技术手段上是具备的，还应尽早开展相关研究。

3 利用模式动物进行中医证候GWAS研究的展望

除人群研究之外，还可以从合适的动物模式系统进行证候的GWAS研究。在各种人群研究中，即使在实验控制的条件下，也很难获得大量的有关疾病所涉病位的组织样本进行分子机制上的分析(如进行心脏或脑区的基因表达)。因此需要严格控制的基因组和环境，又忠实地反映群体的遗传复杂性及个体差异性的实验系统。在这方面，模式动物特别是小鼠具有独特的优势。小鼠的基因组85%以上与人相似［15］，目前各国研究者已经培育出几百种基因组系统变化的遗传参照品系，在研究复杂性状遗传学上发挥了基础性的作用。运用小鼠进行复杂性状的GWAS研究不仅理论与实践上可行，其研究成果也在《自然—遗传综述》等杂志上引起广泛关注，成为一个重要方向［16］。充分利用小鼠遗传信息优势，对不同品系的近交系小鼠及重组近交系(由2种近交系小鼠杂交重组后产生的近交系)小鼠进行分型，是众多小鼠GWAS研究方法中应用性最强的方法。其最大的优点是，由于每个近交系小鼠品系的基因型信息是确定一致的，只需要进行一次基因分型，这样便可以节省大笔用于基因分型的费用。其次，近交系及其杂交子一代小鼠具有同基因(isogenic)性，便于获得稳定的基底及造模表型值，提高了关联分析的精确性和有效性。为增加遗传统计效力，还使用了重组近交系小鼠，目前约300多种。其中种群数量最多、研究使用也最广的是由C57BL/6J和DBA/2J 2个品系衍生而来的BXD重组近交小鼠品系［17］，已有100多种，以该品系为基础的genenetwork．org网站已成为分析基因网络遗传调控的重要工具和数据库［18］。近年来，国际上还进一步将多种近交系进行重组近交，获得了遗传多样性和重组性大为增强的新一代重组近交系小鼠(collaborative cross)［19］。这些基因组各异但是遗传信息确定的小鼠共同组成了遗传参照种群［20］，可以利用不同水平的遗传参照种群小鼠进行多元化的全基因组关联研究。

小鼠是中医证候研究的主要模式动物之一，目前已经积累了大量的研究资料，部分证候模型的有效性也获得了多方面的验证［21］。如方肇勤研究组对小鼠的四诊模型进行了探索，结果显示小鼠可表现出与临床相似的中医证候，并在标准化、客观化和数量化上体现出特定优势［22］。他们以及其他研究人员还进行了不同小鼠品系的比较，发现了品系间中医证候表现的差异，提示遗传对病证差异性的影响［23］。通过对中医证候表现可重复性的量化分析，将其基因组变异性与其基因表达组、蛋白组等差异性进行关联，还可以从系统水平揭示中医证候易感性的物质基础及中医辨证论治个性化医疗的生物学本质。而多种系统性基因组差异小鼠种群的建立，也为中医各种系统生物学研究提供了稳定可重复的平台。小鼠的GWAS方法用于疾病或生理性状的研究已获得令人瞩目的成功，证明它可作为阐释多基因疾病的分子基础的重要手段。这种方法也可以在揭示中医证候的分子基础的研究中发挥重要作用。但是，由于目前国内近交小鼠品系数量较少，其遗传资源还相对匮乏，实验费用相对较高等原因，小鼠的GWAS研究还开展得不多。针对这些问题，我们提出并实施了引进利用国内外小鼠遗传参照种群，建立系统生物学实验平台，开展病证复杂性状遗传学研究的计划。以抑郁症小鼠病证模型为重点进行了前期研究，结果支持证候表现的遗传效应［24］，为下一步进行GWAS研究打下良好基础。

4 结语

传统中医临床实践重视人的生物系统性及人与自然和社会环境的协调统一性，很早就注意到疾病的发生发展及病证表现的多样性依人群、个体禀赋及环境而有别的现象，提出了“因人因时因地”治宜的区别化诊疗理论，这与西方医学随着基因组学的快速发展而勃兴的“个性化医学”方向是一致的［25］。复杂性状遗传学和GWAS的运用，将有利于揭示中医证候的分子及网络物质基础，也为复方的个性化多靶点多层次协同运用治疗疾病提供了依据。可以预期，充分利用小鼠在中医证候的定量化与标准化上的模型优势［26］以及系统化可知的实验小鼠的基因组变异的遗传优势，将为中医基础理论及中医学研究的创新发展和推广应用的飞跃性提高作出贡献。

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Perspectives on the TCM Zheng Research Using Genome-Wide Association Study Approach

CHEN Gang，ZHOU Xin，XUE Wen-da，WU Hao-xin
(Center for Translational Systems Biology and Neuroscience，and Key Laboratory of Integrative Biomedicine of Brain Diseases，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

The scientific nature of TCM Zheng is a key for understanding the hallmarks and advantages of TCM in treatment based on Zheng differentiation and personalized medicine．It is also a fundamental theme of TCM research but remains largely unclear．Here by introducing the concept of complex trait genetics，the authors propose to use related methods，particularly the approach of cutting-edge genome-wide association study(GWAS)to dissect the molecular genetics of the individual differences in TCM Zheng．Moreover，the authors discuss the practicability and necessity to study the molecular and systematic networks underlying Zheng，by taking advantage of genetic reference mouse population resources，and point out the plausible advancement to TCM research and clinic by applying GWAS to validated models of disease-Zheng in the informative mouse population．

TCM Zheng;Complex trait genetics;GWAS;Genetic reference population mice;Model animal

R2-03

A

1006-3250(2017)01-0141-03

2016-06-12

国家自然科学基金资助项目(81673625)-基于PACAPCREB信号通路的越鞠丸快速抗抑郁机制研究;江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20140962)-基于GWAS分析策略研究越鞠丸抗抑郁作用的分子机制研究;江苏省双创项目(2013455)-中医辨证治疗抑郁症的系统生物学研究;江苏六大人才高峰项目(2013-YY-11);南京中医药大学自然科学基金青年基金项目(13XZR006)-基于“五志化火”探讨栀子抗抑郁作用特点及其机制研究;中医学江苏省优势学科中医系统生物学及脑病学创新团队

陈 刚(1972-)男，湖北武汉人，教授，医学博士，博士研究生导师，从事重大脑病中医药治疗的分子与系统生物学研究与中医证候及方剂的系统遗传学和系统生物学研究。