线粒体胆固醇转运蛋白研究进展

汤昆梁慧子张漓

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）2上海体育学院3北京市通州区潞河中学

线粒体胆固醇转运蛋白研究进展

汤昆1，2梁慧子3张漓1

1国家体育总局体育科学研究所（北京100061）2上海体育学院3北京市通州区潞河中学

类固醇激素在维持人体运动能力、肌肉力量和疲劳恢复等方面发挥了巨大作用。胆固醇跨线粒体膜转运，是影响类固醇激素合成的关键步骤，已有研究表明StAR、TSPO、VDAC、ATAD3A等多个蛋白与此过程密切相关。本文对上述线粒体膜相关蛋白的生理学特性、结构、功能等方面进行了阐述，探讨了运动与转运蛋白之间关系，以期更系统地理解胆固醇跨膜转运机制，为最终解决运动训练导致的内分泌紊乱提供思路。

类固醇激素合成；胆固醇转运；类固醇合成急性调节蛋白；转位蛋白

研究表明，运动可致类固醇激素水平变化，从而影响激素分泌的调节，甚至会导致内分泌失调，影响运动员的身体机能和运动状态[1]。睾酮、糖皮质激素等类固醇类激素均以胆固醇为前体物质，研究发现，类固醇激素生成的真正限速步骤是胆固醇跨线粒体膜转运[2]，此过程涉及到线粒体内外膜上多个蛋白。现对其中具有代表性的StAR、TSPO、VDAC、ATAD3A等蛋白作如下探讨，梳理分析各蛋白之间的相互作用，为进一步理解胆固醇转运提供参考。

1 位于线粒体外膜的蛋白

1.1 S S t t A A R R

1.1.1 S S t t A A R R的生物学特性

StAR，即类固醇激素合成急性调节蛋白（steroido⁃genic acute regulatory protein，StAR），是一种激素可诱导的线粒体蛋白，有37 kDa、32 kDa、30 kDa三种形式，且37 kDa作为30 kDa蛋白质的前体，其半衰期仅有1～2 min[3]。蛋白质的N端序列包含线粒体引导肽，维持StAR与线粒体外膜接触时的寻靶能力[4]；C端为生物活性部位，胆固醇可以结合在一段由210个氨基酸残基组成的脂质结合域（START）上[5]。在类固醇生成过程中，StAR发挥了不可替代的作用，早在1995年Lin等研究人员就发现，先天性肾上腺脂样增生症这一潜在致死性疾病正是StAR基因突变导致的。

含氮类激素合成之后可以形成囊泡，而类固醇生成细胞中没有类似储存类固醇激素的结构。因此，类固醇激素分泌调节过程无法像含氮类激素一样通过控制囊泡分泌来实现，这就导致了类固醇激素需要从前体物质开始从头合成（de novo synthesis）。StAR活性与类固醇激素生物合成特征一致，在上游促激素的刺激下急性合成StAR。只有新合成的StAR蛋白才有活性，且活性变化很快。研究发现，StAR接触到线粒体基质后，立刻开始降解，半衰期只有4～5 h[6]。StAR蛋白自身活性变化还存在以下特点：1）StAR功能只有在外膜上或镶嵌在外膜之中才能发挥，但固定位置持续时间很短；2）StAR蛋白的活性与在外膜上或内的存续时间成正相关；3）StAR向内膜转运是失活的过程；4）StAR蛋白的前62个氨基酸排列顺序可以特异性减慢向内膜运动的速度。

1.1.2 S S t t A A R R调控通路

因为StAR自身活性变化非常迅速，所以，关于StAR研究的侧重点便落在了对其合成调控通路的研究上。研究发现[7]，上游促激素通过G蛋白偶联的信号转导通路在cAMP信号系统的介导下，对StAR mRNA进行调控，从而对StAR蛋白活性进行调节。

cAMP信号系统以cAMP为第二信使，通过cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase，PKA），进而使下游信号蛋白丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。当cAMP浓度升高后，C亚基和R亚基解离，C亚基以单体的形式从PKA中游离出来后，即具有了蛋白激酶的活性。游离的C亚基一部分在细胞质，另一部分进入细胞核，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（cAMP responsive elementbinding protein，CREB）等蛋白，磷酸化后CREB与目标蛋白上的cAMP反应元件（cAMP responsive element，CRE）结合区（5'-TGACGTCA-3'）[8]特异结合从而参与基因转录调节。CREB的磷酸化程度除了受PKA的正向调控之外，也受到蛋白磷酸酶负向调控的影响。

尽管cAMP-PKA是调控StAR表达、类固醇激素合成的主要信号通路，意外的是，StAR基因的启动子缺少完整的CRE序列，只存在三个CRE半序列，这就导致了CREB不能与启动子进行有效的结合，因此StAR蛋白需要转录因子完成信号转导、完善调控通路。有很多转录因子与StAR基因表达过程相关：SF-1、GATA-4、SREBP。在诸多调控因子中，SF-1被认为是最重要的转录因子[9，10]，这是因为如果敲除SF-1，StAR mRNA便无法正常表达；另外，维持DNA-蛋白质相互作用、促进StAR启动子达到最大活力都需要有SF-1的存在。

1.2 T T S S P P O O

1.2.1 T T S S P P O O的生物学特性

转运蛋白（Translocator protein，TSPO）是常见的线粒体蛋白，因其与苯二氮安定有较高的亲和力，最初命名为外周型苯二氮卓受体转运蛋白，广泛分布于肾、肝、脑、心、性腺、血管等多个组织[11]。Wang等[12]研究了绿色荧光蛋白标记的大鼠，结果显示TSPO在内分泌和生殖系统的类固醇激素生成细胞、消化系统上皮细胞等细胞中表达最高。在细胞内，TSPO主要定位在线粒体外膜，并且多集中于内外膜接触位点。

TSPO由核基因编码，在细胞质中合成，然后输入线粒体。TSPO进入线粒体的步骤：1）TSPO在细胞质分子伴侣Hsc70和Hcp90协助下，进行寻靶；2）与线粒体外膜结合之后，TSPO在线粒体细胞膜蛋白TOM70的作用下，从分子伴侣上释放；3）TSPO与Metaxin1等蛋白组合构成66kDa复合体，插入线粒体外膜；4）一旦插入完成，TSPO就与其他蛋白共同构成相对分子质量为800kDa的蛋白复合体。

1.2.2 T T S S P P O O的结构特点

大量研究发现，不同物种TSPO的结构基本一致。每个TSPO单体都存在有5个跨膜α螺旋（transmem⁃brane，TM），每一个α螺旋都由21个氨基酸残基组成，俯视视角下，以顺时针为序依次命名为TM1-TM2-TM5-TM4-TM3[13]。这些跨膜螺旋肽链紧密结合成桶状，内部凹陷有与PK11195等配体结合的结合位点。每个跨膜螺旋之间都通过环状结构（loop）相连，TSPO的C端、TM3-TM4环，TM1-TM2环位于线粒体外膜外侧；N端、TM4-TM5环、TM2-TM3环在线粒体膜间隙，其余部分则镶嵌在线粒体外膜之中。TSPO的环除了TM1-TM2环之外都很短，其主要作用是封闭TSPO内部凹陷，防止PK11195等配体从结合位点脱离[14]。

1.2.3 T T S S P P O O与胆固醇结合位点

随着研究分子结构学的方法的进步，TSPO的分子结构在转运过程中与胆固醇结合位点也越发明确。Papadopoulos等率先提出在TSPO上靠近C端的147-159处有一段序列胆固醇识别序列（cholesterol recogni⁃tion amino acid sequence，CRAC），胆固醇以毫摩尔级的亲和力与之相结合[15]。Fantini等[16]鉴别出CRAC的模体序列为L/V-X（1–5）-Y-X（1–5）-R/K（X表示任意一种氨基酸）。研究发现[17]这一序列不仅出现在TSPO蛋白的C端，在TSPO其他跨膜螺旋上亦有发现，在TSPO上普遍存在的CRAC序列，可以提高TSPO结合胆固醇结合的能力与紧密程度。

除此之外，近来也有研究者[18]观察到在TSPO上另外还有一段区域参与胆固醇结合。这段区域被称为增强胆固醇结合域（LAF），位于C端CRAC附近（144-146），主要由Leu-Ala-Phe等三个氨基酸残基组成。这段序列在胆固醇与TSPO结合过程中同样发挥着不可替代的重要作用。如果这段结合域氨基酸残基发生变异，则会显著影响TSPO结合胆固醇的能力[19]。另外Li等[20]发现，这段序列在哺乳动物中具有高度保守性，然而在细菌之中保守性较差，这就导致了尽管细菌TSPO中也存在CRAC序列，却由于缺乏LAF序列，其结合胆固醇的能力比哺乳动物TSPO低了1000倍[21]。这也导致了关于TSPO在胆固醇结合、转运过程中的作用和机制等方面的研究只能通过培养哺乳动物TSPO进行，而无法将研究细菌TSPO所得的研究成果直接推广到哺乳动物TSPO上。

1.3 V V D D A A C C

电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage-dependent anion channel，VDAC）广泛存在于真核生物粒体外膜，相对分子质量为30 kDa，在多个物种之间都具有高度保守性[22]。研究显示VDAC是由19个β折叠组成的β-桶状结构以及N末端25个氨基酸残基组成的α螺旋组成的[23]。VDAC的功能与膜电位有关，当膜电位较低时，VDAC具有阴离子选择性且有较高的传导效率；而膜电位大于30～40 mV时，则具有阳离子选择性且处于低传导状态[24]。除了膜电位之外，VDAC功能还受到微管蛋白等其他蛋白的影响，VDAC与其他蛋白结合之后影响VDAC参与调节细胞凋亡和呼吸作用[25]。

诸多研究显示，胆固醇对VDAC功能产生影响，不仅如此，VDAC也参与胆固醇转运和分布。Hulce等[26]通过细胞培养的方式证实，胆固醇可以与哺乳动物VDAC相结合。Campbell等[27]利用肝癌细胞MH7777研究VDAC在胆固醇转运过程中的作用。结果发现，缺少VDAC的MH7777细胞线粒体外膜上胆固醇异常增加，几乎增加到了正常肝脏细胞的2倍；然后，研究者再将VDAC转染到细胞中，线粒体外膜胆固醇显著下降。这反映了VDAC在维持线粒体安静状态下胆固醇正常分布方面发挥了重要作用。在类固醇生成细胞中由VDAC和ANT共同参与构成的线粒体膜通透性转换孔（mitochondria permeability transition pore，MPTP）的开放和关闭对于胆固醇进入线粒体内膜有一定影响。

2 位于线粒体内膜的蛋白

三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATPase family AAA domain-containing protein 3A，ATAD3A）在人体含有两种不同的基因亚型（Atad3A和Atad3B），都位于染色体1p36.33[28]。研究发现[29]，ATAD3A的C端固定在线粒体基质上，N端镶嵌在线粒体外膜上。这样桥梁般的构造，使ATAD3A除了可以参与多种细胞应答[30]之外，在线粒体与内质网通讯、肿瘤形成等方面也发挥着重要作用。

线粒体本身并不能合成胆固醇，线粒体进行生物合成所需的胆固醇都是从内质网产生并转运到线粒体的。目前的研究发现，主要有2条从内质网转运胆固醇到线粒体的转运通路：1）通过细胞膜载体转运蛋白转运到线粒体；2）通过内质网-线粒体膜接触位点进行转运。大多数内源性合成的胆固醇是通过第一条通路进行转运。然而，Lange等[31]研究发现，第一条通路只有在细胞膜胆固醇水平达到一定的阈值之后才会被激活。所以，后一条通路在面对类固醇急性合成的要求时，起到了非常重要的作用。Duarte等[32]敲除了内质网-线粒体接触位点的重要组成蛋白——线粒体融合素基因-2（Mfn-2），结果发现，在大鼠睾丸间质细胞中，cAMP诱导的类固醇生成显著降低。与Mfn-2一样，ATAD3A也被认为是内质网-线粒体接触位点的重要组成部分。Issop等[33]通过严谨的实验证实，相对分子质量为67 kDa的ATAD3A是内质网-线粒体膜接触位点转运胆固醇过程的关键组成部分。

胆固醇从内质网转运到线粒体之后，并非均匀散布在内外膜上，绝大多数胆固醇主要是聚集在线粒体内外膜转位接触点[34]。ATAD3A不只是内质网-线粒体接触点的重要组成部分，也参与构成线粒体内外膜转位接触点。这些接触点不但可以增强胆固醇聚集，在激素的刺激下还可以促进胆固醇进入线粒体内膜。ATAD3A不仅参与构成线粒体内外膜转位接触点，还可以同时调控C端和N端的活动来调控内外膜相互作用。

3 各蛋白之间相互作用

3.1 S S t t A A R R与T T S S P P O O

Hauet等[35]指出，StAR、TSPO相互协作，共同参与胆固醇转运。无论敲除StAR或者TSPO都会导致在hCG刺激下的MA-10细胞不能维持孕烯醇酮生成。不仅如此，StAR在缺少TSPO或者被使用TSPO抑制剂的细胞中不能从37 kDa加工成30 kDa的成熟形态。这提示了两者在胆固醇转运过程中都是不可缺少的，并且StAR功能的发挥依赖于TSPO。在类固醇生成过程中StAR和TSPO存在相互协作已经得到了广泛的认可，而其协作模式却仍有一定争议。多数研究者认为在激素诱导的情况下，胆固醇先与StAR结合，随后StAR将胆固醇转运至TSPO之上，再由TSPO转运进入线粒体内膜。与之相反的是，Miller等[36]则认为，胆固醇先在TSPO结合，而StAR的作用是将原先结合在TSPO之上的胆固醇从TSPO上卸载下来。笔者认为，对其协作模式的争议或与TSPO和StAR来源、预处理方式有关，并且随着TSPO各级结构的明确，其与StAR的协作模式将得到进一步验证。

3.2 S S t t A A R R与V V D D A A C C

Bose等[37]以体外培养的cos-1、MA-10等细胞为研究对象，采用转染技术和基因敲除技术，研究StAR、VDAC等蛋白在类固醇生成过程中的相互作用。结果发现，敲除VDAC1后，尽管COS-1细胞中还有StAR蛋白，但是孕烯醇酮的产量显著减少。Western Blot测试发现，VDAC1敲除后，StAR无论是37 kDa的前体、32 kDa的中间体亦或是30 kDa的成熟体，表达都显著下降；StAR产生错误折叠的概率则显著增加。Bose甚至还发现StAR蛋白在线粒体外膜上第一个接触的蛋白是VDAC1。这一精妙的实验揭示了StAR和VDAC在类固醇生成过程中相互作用及其重要性，即只有在VDAC1的协助下，StAR蛋白才能正确修饰、加工和折叠，才能形成有正确构象和生物学活性的功能蛋白。随后Bose[38]主持的另一项研究通过动物实验又进一步证实了其细胞培养的结果。Bose及其团队通过细胞培养和动物实验充分反映了VDAC在调控类固醇生成过程中发挥了重要作用，并且指出这种作用是通过与StAR的相互作用实现的。

3.3 T T S S P P O O与V V D D A A C C

TSPO和VDAC这两个蛋白都各自在不同程度上调节关键转运蛋白StAR，除此之外，这两个蛋白彼此之间也存在一定程度的相互作用。Gatliff等[39]在研究线粒体自噬时，通过利用siRNA暂时敲除TSPO，或利用cDNA过表达TSPO等方式调控TSPO/VDAC1的比例等方式发现，TSPO/VDAC1的比例增加，会抑制线粒体ATP生成，提高ROS水平。这提示了TSPO与VDAC1的相互作用不仅对于调控胆固醇转运，而且对于维持线粒体的结构和功能，都有非常重要的作用。

3.4 transduceo o s s o o m m e e

StAR、TSPO、VDAC、ATAD3A等线粒体蛋白彼此之间在结构和功能上有着紧密的联系，并且在胆固醇线粒体转运过程中相互配合，在不同阶段分别发挥着独特的作用。上述线粒体蛋白构成了功能性蛋白复合体，镶嵌在线粒体膜上的TSPO、VDAC、ATAD3A等蛋白命名为"transduceosome"。随着研究的深入，研究人员基于此蛋白复合体，提出了多种转运模型，其中最受广泛认可的是Rone等人[40]提出的转运模型，transduceo⁃some在StAR的引导下，调控着胆固醇线粒体转运：1）在线粒体外膜上，通过TSPO汇聚、结合胆固醇；2）StAR开始启动向内转运的过程；3）VDAC负责固定TSPO和StAR；4）最后在ATAD3A构成的内外膜之间的连接桥梁的协助下将胆固醇转运至线粒体内膜。这一转运模型，将原本相对孤立的转运蛋白研究糅合成一个整体，开拓了研究者的思路，有力推进了胆固醇转运研究的发展。

4 运动对各转运蛋白的影响

在参与线粒体胆固醇转运的诸多蛋白中，除了StAR之外都是镶嵌在膜中的膜内在蛋白，分离和纯化存在一定难度，因此，运动对转运蛋白的影响主要侧重于运动对StAR的影响，尤其是运动对StAR mRNA的影响。不同运动方案所引起的低睾酮现象都反映：在长期运动训练后，StAR的表达都会产生下降[41]。罗齐军等[42]研究发现，大鼠以最大跑速25 m/min完成5周递增负荷跑台训练，在训练组大鼠睾酮水平下降时，同样观察到StAR mRNA表达下降。Jana等[43]通过迫使大鼠进行8周力竭性游泳后观察到，StAR蛋白表达显著下降，但P450scc酶活性并未发生显著变化。

然而以上研究的局限在于并未明确大鼠在上述运动训练过程中所从事的是有氧运动还是无氧运动。随着竞技体育竞争越发激烈，运动员训练强度不断增加，为了适应训练和比赛的要求，乳酸耐受力训练在训练中所占的比重越来越大。为了研究在耐乳酸训练过程中，大鼠睾酮的变化和原因，严翊等[44]设计了间歇性负重游泳运动方案。然而结果却发现，持续5周，每天一练的情况下，StAR mRNA表达并未随着睾酮的下降而下降；但是，如果进行6周训练，且最后一周每天两练，StAR mRNA表达就出现显著下降，且与运动量关系更密切。据此研究者推测，StAR mRNA下降会导致间质细胞内胆固醇转运发生障碍加剧睾酮水平下降。严翊等人设计的大鼠负重游泳模型，游泳条件稳定、运动强度可控、重复性好，可以用来作为今后运动性低睾酮动物建模参考。

5 总结与展望

类固醇激素在维持运动员身体机能状态、保证训练质量和效果等方面发挥着重要的作用。作为前体物质的胆固醇其转运过程中所涉及到的各个蛋白结构、生理机能及作用，以及蛋白之间的相互作用都有较为清楚的认识。然而，总结既往研究可以发现很多不足之处，例如：之前的研究方式多以体外细胞培养为主，在体研究较少；各个蛋白如何有机整合成胆固醇转运复合体、各蛋白产生相互作用的机制等问题尚未涉及；运动对前文所述各转运蛋白尤其是镶嵌在膜中的内在蛋白的影响还未见报道；运动在转录水平影响StAR这一关键蛋白的机制也有待回答。这些问题制约了对胆固醇转运、类固醇激素合成等方面的认知，应该在将来的研究中得到充分的关注。

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2016.08.29

国家体育总局科技服务工作项目（委16-18），国家体育总局体育科学研究所基本科研业务经费（基本16-28）

张漓，Email：zhangli@ciss.cn