中性粒细胞凋亡与炎症损伤的关系①

孙晓红 李洪涛 李嘉仪 李鑫阳 安思训

(北华大学基础医学院，吉林 132013)

中性粒细胞凋亡与炎症损伤的关系①

孙晓红 李洪涛 李嘉仪 李鑫阳 安思训

(北华大学基础医学院，吉林 132013)

中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil,PMN)是介导炎症反应的重要效应细胞，在机体非特异性免疫防御中起重要作用。正常生理情况下PMN的增殖与凋亡保持动态平衡，既有利于机体的防御反应，又有利于炎性反应的消散。但在严重创伤、脓毒血症、烧伤、缺血再灌注等条件下，PMN 过度激活、聚集于靶组织、释放大量毒性介质及产生大量的炎性细胞因子，超过防御需要、持续过度的炎性反应会造成正常组织细胞的损伤。PMN的数量、功能及存活时间会影响炎症反应的发生、发展过程及转归。适时抑制PMN过强的效应或促进其凋亡则有利于减轻机体损伤。目前，以PMN过度浸润为特征、免疫系统控制失调产生的非特异性炎症，与哮喘、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、急性肺损伤、牙周炎、结核病及急性心肌梗死等多种疾病有关。因此了解PMN凋亡机制，适度地调控PMN凋亡，对于治疗创伤、控制炎症具有重要意义。本文就中性粒细胞凋亡及凋亡抑制在炎症中的作用等进行综述。

1 中性粒细胞凋亡和清除

PMN属终末分化细胞，正常生理情况下分化成熟后24 h内启动自发性凋亡。细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡类型，是在基因控制下的主动性程序化死亡，其启动与进展是基因调控、受体识别和信号转导的共同结果。PMN除了自发性凋亡外，在激素、脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)- α等多种因素的作用下，可发生凋亡的加速或延迟[1]。

PMN的凋亡主要包括外源性途径(即死亡因子受体途径)和内源性途径(即线粒体途径)。外源性途径主要由死亡因子受体介导，死亡因子受体属于TNF受体超家族，包括TNFR1、TRAIL-R和CD95/FAS，与相应的配体(TNF-α、TRAIL和FAS-ligand)结合后，向细胞内部传递凋亡信号，诱导PMN凋亡。内源性途径主要是线粒体介导，线粒体内膜的通透性改变形成通透性转变孔道，导致线粒体功能发生变化，介导PMN凋亡。PMN的凋亡过程包括胞外刺激、胞内信号转导及核内基因转录活化等，最终形成细胞凋亡的典型变化，其核心环节是胞内信号转导[2,3]。在PMN凋亡信号的胞内转导传递过程中， 半胱天冬酶(Caspase)蛋白处于细胞凋亡下游，caspase蛋白的表达是各种细胞凋亡机制的最后共同通路。Caspase是白细胞介素(IL) -1β 转化酶家族的总称，IL-1β 转化酶能活化 IL-1β，又能裂解细胞内维持结构和功能的基质蛋白，介导细胞凋亡。PMN能表达Caspase-1、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-8和Caspase-9等。死亡因子受体途径被激活后，可进一步激活下游Caspase-8、Caspase-3通路；线粒体途径被激活后，可进一步激活下游Caspase-9、Caspase-3通路。在PMN凋亡及凋亡加速过程中有Caspase-3、Caspase-8的显著活化，而在凋亡延迟的PMN中，有Caspase-3、Caspase-9活性受抑制或下降。可见，Caspase-3是死亡因子受体途径或线粒体途径致细胞凋亡信号转导的关键节点和交汇点，是凋亡信号的执行者。

PMN凋亡是机体限制自身炎症反应的一种重要方式，凋亡的PMN被吞噬细胞清除是炎症消散的关键。凋亡的PMN会有内在生化改变及细胞表面分子标志物的变化，这是吞噬细胞特异性识别和清除的基础。吞噬细胞在吞噬凋亡的PMN后产生和释放的是多种抑炎介质，这种凋亡和清除间的动态平衡既防止过度激活的PMN释放炎性细胞因子等加重炎症反应，又避免凋亡抑制的PMN继发性坏死后释放毒性内容物而加重周围组织损伤[4]。

2 中性粒细胞凋亡抑制在炎症损伤中的作用

PMN凋亡是一个受多基因调节和众多细胞因子参与及多种信号转导途径调控的复杂过程，与PMN 凋亡抑制相关的调控因素包括凋亡相关基因及凋亡抑制因子的表达、Caspase-3 活性降低、Fas/FasL信号途径抑制、p38MAPK信号途径抑制、ERK信号途径激活及核因子-κB活化等。PMN凋亡抑制导致存活时间延长，会增加组织损伤的严重程度，导致炎症迁延不愈。所以，PMN凋亡抑制是多种非特异性炎症发生的机制及炎症反应进一步发展、加重的原因，通过检测PMN的凋亡抑制情况，可以反映原发病病情程度、预示疾病的发展及转归。

2.1凋亡相关基因的表达与PMN凋亡抑制 PMN凋亡相关基因多达数十种，其中B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白是细胞凋亡过程中起关键作用的一类蛋白质，在线粒体途径中起着重要的调控作用。Bcl-2家族包括抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等及促凋亡基因Bax、Bid、Bak、Bim等。目前一致认为，PMN不表达重要的抗凋亡蛋白Bcl-2，可表达生存期较短的抗凋亡蛋白 Mcl-1、Bcl-xL及A1，可持续表达促凋亡蛋白Bax、Bid、Bak和Bad[5]。通过抗、促凋亡基因的平衡调节，抑制或促进PMN凋亡。Mcl-1主要位于线粒体外膜，抑制线粒体中细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。Bax蛋白可在线粒体膜上形成新的通道，影响线粒体膜的通透性及线粒体膜对其他因子的反应性，导致细胞色素C释放，Caspase-9激活，促进细胞凋亡。Bcl-2蛋白能抑制细胞凋亡，当蛋白Bax与Bcl-2形成异源二聚体时，使Bcl-2的抗凋亡能力丧失，促进细胞凋亡；当蛋白Bax形成同源二聚体时，则抑制细胞凋亡。研究发现：子痫前期患者Mcl-1mRNA表达显著增加和Caspase-3活化抑制是PMN凋亡延迟的重要机制，PMN凋亡延迟导致其活性增加，进一步介导内皮细胞的损伤，参与了子痫前期的病理生理过程[6]；LPS是一种重要的致炎因子，可用于多种炎症细胞模型及动物模型的建立，其机制之一是LPS能降低中性粒细胞内Bax蛋白的表达，抑制PMN凋亡，影响炎症反应的强度及发生、发展进程[7]。以上分析说明，抗凋亡基因高表达，促凋亡基因低表达，均会导致PMN凋亡受到抑制而和炎症的发生及发展相关。

2.2凋亡抑制因子Survivin的表达与PMN凋亡抑制 Survivin 是目前已知的最强的凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，在成熟PMN中高表达。Survivin主要通过抑制Caspase级联反应下游的Caspase-3、Caspase-7活性，发挥抗凋亡作用[8]。而且随着炎症程度的加重，Survivin表达水平逐渐升高，其表达水平与炎症的活跃程度显著相关[9]。研究发现：重症急性胰腺炎模型大鼠PMN凋亡率降低，且凋亡率与Survivin蛋白和mRNA表达水平呈显著负相关，表明Survivin通过抑制PMN凋亡导致重症急性胰腺炎的发生与发展[10]。

2.3Caspase-3活性降低与PMN凋亡抑制 Caspase-3是启动细胞凋亡的关键酶，处于凋亡级联反应通路的核心位置[11]。而且Caspase-3活性可在凋亡PMN上检测到，并与形态和生化变化同步。Caspase-3通常以无活性的前体形式存在于细胞质中，细胞内外环境变化及各种因素相互作用产生的凋亡信号将其激活后，可激活DNA酶，介导细胞染色体DNA碎裂等，启动凋亡。在炎症反应状态下，炎性因子分泌的异常，其激活受到抑制，不能正常调节PMN凋亡，难以促进炎症的消退。另外，LPS、粒细胞集落刺激因子等可使Caspases和IL-1β在PMN上表达增加，使PMN凋亡表达趋缓[12]。研究证实：胆道梗阻大鼠外周血PMN表达Caspase-3活性由术后1 d至10 d持续性下降，PMN凋亡率随时间延长进行性减少，说明Caspase-3活性降低导致的PMN 凋亡抑制参与了梗阻性黄疸的炎症反应过程，并与炎症反应的持续和加强有关[13]；子痫前期患者Caspase-3活化下调，其活化量与PMN凋亡率相一致，Caspase-3活化抑制导致的PMN凋亡延迟，参与了子痫前期的疾病发展过程[6]。

2.4Fas/FasL信号途径抑制与PMN凋亡抑制 Fas属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种膜结合蛋白，FasL属于肿瘤坏死因子家族成员，为Ⅱ型跨膜糖蛋白。Fas与FasL结合可进一步激活Caspase蛋白酶家族、Bcl-2家族、p53等凋亡相关基因，诱导细胞凋亡。中性粒细胞通过表达Fas和FasL，调控细胞凋亡，保持数量的稳定。Fas在组织细胞以及炎症细胞中广泛表达，sFas是血浆可溶性的Fas，是由于Fas基因的插入缺失所致，sFas使得正常Fas存在也难以进行凋亡作用。IL-8可通过抑制Fas和FasL的结合，抑制PMN凋亡。研究发现：脓毒症患者血清外源性凋亡途径蛋白sFas浓度增加，PMN凋亡减少，病情严重时凋亡减少更加明显，且凋亡率与血清sFas呈负相关，说明血清sFas浓度增加导致的PMN凋亡抑制与疾病的发生及病情严重程度相关[14]。

2.5p38MAPK信号途径抑制及ERK信号途径激活与PMN凋亡抑制 丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK) 是一组细胞外信号调节蛋白激酶，包括细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38MA PK等。MAPK信号通路是多级激酶的级联反应，真核细胞中已确定出 4 条MAPK信号转导通路，其中，p38MAPK及ERK信号途径和PMN的凋亡密切相关。p38MAPK是MAPK家族中的重要组成部分，细胞外的放射线、紫外线、促炎因子等，可使p38MAPK活化促进PMN凋亡。ERK途径主要参与细胞的增生和分化，细胞因子GM-CSF、G-CSF、IL-8等可激活ERK途径抑制PMN凋亡，使用ERK特异性抑制剂可以促进PMN凋亡。这两条途径相互调节，共同制约着PMN的最终生物学效应。另外，p38MAPK和ERK共同参与了LPS对PMN凋亡的调控，p38MAPK促进PMN凋亡，而ERK抑制PMN凋亡。研究表明：免疫调节剂1，25(OH)2D3通过活化p38MAPK 信号通路，促进慢性阻塞型肺疾病PMN凋亡[15]；IL-17在体外对结核病患者PMN凋亡具有双重调控作用，高浓度时促进凋亡，低浓度时抑制凋亡，抑制作用与ERK途径激活有关，所以控制结核炎症反应的延迟应考虑ERK途径对IL-17的作用[16]。

2.6核因子-κB活化与PMN凋亡抑制 核因子-κB (Nuclear factor-κB,NF-κB) 蛋白家族是有多效性的核转录因子，是多个信号通路的交汇点。NF-κB能介导多种炎症介质及炎性细胞因子转录、调控与凋亡相关基因(如Bcl-2家族成员)的表达来参与PMN凋亡的调控，NF-κB 的激活可抑制多种细胞凋亡，因而NF-κB在急性炎症反应中的中心调节作用备受关注。细胞因子、炎症介质、LPS等相关刺激均与NF-κB的活化有关，促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF及TNF-α等可抑制PMN凋亡，抗炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13等可促进PMN凋亡[17]。持续活化、凋亡延迟的PMN，可合成和分泌多种细胞因子，在PMN内部及其他细胞间形成细胞因子网络，促炎与抗炎因子间的平衡被打破、炎症因子产生失控是导致炎症失控的重要原因之一；另外，凋亡延迟的PMN可激活NF-κB，进一步诱导IL-1β、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子的释放，引起瀑布效应，加重炎症反应。研究证实：LPS致急性肺损伤大鼠支气管肺泡灌洗液中PMN凋亡率明显降低，而 NF-κB抑制剂组凋亡率增加，说明 NF-κB的活化导致的PMN凋亡延迟参与了急性肺损伤的发生过程，且抑制NF-κB的活化可使PMN的凋亡加快[18]；羊水栓塞肺损伤家兔TNF-α、IL-1β的表达显著升高，PMN凋亡率降低，说明TNF-α、IL-1β介导的炎性反应及PMN凋亡抑制，使肺部炎性反应升级而加重肺损伤[19]。IL-18是新近发现的促炎细胞因子，由不具有生物活性的母体蛋白合成，需要被Caspase-1裂解为具有活性的成熟蛋白[20]，通过调控促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白、TNF-α以及激活NF-κB等抑制PMN的凋亡。研究发现： IL-18可以延迟酒精中毒和烧伤患者外周血PMN 的凋亡而加重病情[21]；在重症急性胰腺炎模型大鼠血清中IL-18含量升高，PMN的凋亡率与IL-18的含量呈负相关，与胰腺病理评分亦呈负相关，进一步说明IL-18参与了重症急性胰腺炎大鼠PMN的凋亡延迟作用[22]；百草枯(Paraquat,PQ )中毒致肺损伤大鼠血清TNF-α水平升高，支气管肺泡灌洗液中PMN数量显著增加，肺组织中PMN大量浸润，NF-κB抑制剂干预组均降低，提示炎症因子的合成及NF-κB活化是PMN 凋亡延迟、引起大量PMN 在肺内聚集、持续发挥作用而引起肺损伤的主要机制[23]。

3 中性粒细胞凋亡抑制性炎症损伤的治疗

目前，对非特异性炎症还没有特效药物来治疗，临床上应用的抗炎药物如肾上腺皮质激素类与非甾体类等，只能缓解症状，且毒副作用大。所以，新的治疗策略旨在有效阻止或逆转 PMN大量活化，包括抑制促炎因子的释放、促进抑炎因子的释放、促进Caspase-3激活、抑制NF-κB活化及与凋亡抑制相关的信号转导通路的抑制剂等，这为筛选新的抗非特异性炎症药物提供了广阔的前景。现有研究发现：氨基水杨酸类制剂能降低结肠炎模型组大鼠血清 IL-8水平及抑制PMN凋亡，减轻炎症反应和黏膜损伤[24]；奥曲肽治疗急性胰腺炎患者7 d 后外周血 IL-8和TNF等的表达明显降低，PMN凋亡率显著增加，提示其治疗机制是抑制炎症因子的释放及纠正PMN凋亡延缓[25]；使用免疫调节剂1，25(OH)2D3治疗2型糖尿病伴牙周炎患者，TNF-α、IL-1β、IL-6及中性粒细胞弹性蛋白酶水平降低，PMN凋亡率升高，说明1，25(OH)2D3能抑制炎性介质的表达及改善PMN凋亡延迟[26]。联合使用骨髓间充质干细胞与大承气汤可降低重症急性胰腺炎模型大鼠TNF-α与IL-6水平而使IL-10含量升高，促炎因子的减少及抗炎因子的升高，能改善大鼠胰腺组织损伤，有利于病情治疗[27]。乌司他丁治疗重症急性胰腺炎大鼠血清淀粉酶水平、胰腺组织病理学评分均降低，Caspase-3和 Caspase-8活性明显增高，与PMN凋亡增加一致，提示乌司他丁可明显增高Caspase-3和 Caspase-8活性，促进PMN凋亡，减轻炎症反应[28]；PQ可促进活性氧类物质产生、NF-κB活化及抑制Caspase-3表达，抑制PMN凋亡，这种效应可被活性氧类物质抑制剂及NF-κB抑制剂逆转，这为PQ中毒的治疗提供了新的思路[29]。以上分析说明，与中性粒细胞凋亡抑制相关的炎性因子、基因及信号转导途径等都可作为抗炎药物筛选的新靶点。

综上分析，PMN凋亡直接影响着炎症的进展情况，炎症部位的PMN只能以凋亡或继发性坏死的方式被清除，而凋亡是对周围组织损伤最小的清除途径。PMN凋亡是受多种外界因素作用、多种基因参与、涉及众多细胞因子及多条凋亡途径等的复杂调控网络，PMN凋亡抑制是多种炎症损伤的发生、发展及病情加重的机制，适时对中性粒细胞的凋亡过程进行调控，对炎症的控制会达到较好的效果。所以，研究中性粒细胞凋亡机制对临床抗炎药物的研发、非特异性炎症性疾病的治疗具有重大意义。

[1] O′Neill LAJ. Innate immunity:squelching anti-viral signalling with NLRX1[J].Curr Biol,2008,18(7):R302-R304.

[2] Wood LG,Garg ML,Gibson PG. A high-fat challenge increases airway inflammation and impairs bronchodilator recovery in asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2011,127(5):1133-1140.

[3] Scott HA,Gibson PG,Garg ML,etal. Airway inflammation is augmented by obesity and fatty acids in asthma[J].Eur Respir J,2011,38(3):594-602.

[4] Abraham E.Neutrophils and acute lung injury[J].Crit Care Med,2003,31(4):S195-199.

[5] Akgul C,Moulding DA,Edwards SW. Molecular control of neutrophil apoptosis[J]. Febs Lett,2001,487(3):318-322.

[6] 黄艳君,寿华锋,刘小利,等. 子痫前期患者外周血中性粒细胞凋亡及Mcl-1、caspase-3表达的研究[J].中国妇幼保健,2008,23(27):3881-3883.

[7] 高 燕,叶迎春,王 栩,等. TLR 激动剂对中性粒细胞 Bax蛋白表达的影响[J].现代预防医学,2011,38(21):4451-4453.

[8] Kanwar RK,Cheung CH,Chang JY,etal. Recent advances in anti-survivin treatments for cancer[J].Curr Med Chem,2010,17(15):1509-1515.

[9] Ferrario A,Luna M,Rucker N,etal. Pro-apoptotic and anti-inflammatory properties of the green tea constituent epigallocatechin gallate increase photodynamic therapy responsiveness[J].Lasers Surg Med,2011,43(7):644-650.

[10] 朱树养,陈卫昌,蔡笃雄. 重症急性胰腺炎外周血中性粒细胞凋亡及其调控机制的研究[J].中华胰腺病杂志,2006,6 (5):277-280.

[11] Twomey C,Mccarthy JV. Pathways of apoptosis and importance in development[J].J Cell Mol Med,2005,9(2):345-359.

[12] Baines KJ,Simpson JL,Bowden NA,etal. Differential gene expression and cytokine production from neutrophils in asthma phenotypes[J].Eur Respir J,2010,35(3):522-531.

[13] 邓雪松,倪 勇,王成友,等. Caspase-3 活性改变对胆道梗阻大鼠中性粒细胞凋亡的影响[J].安徽医学,2012,33(12):1620-1623.

[14] 郦珊珊,黄培志,童朝阳,等. 不同程度脓毒症患者外周血中性粒细胞凋亡率改变及其机制的探讨[J].中国临床医学,2008,15(5):712-714.

[15] Yang H,Long F,Zhang Y,etal. 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 induces neutrophil apoptosis through the p38 MAPK signaling pathway in chronic obstructive pulmonary disease patients[J].PLoS One,2015,10(4):e0120515,1-10.

[16] 姜丽娜,姚春艳,金齐力,等. 白细胞介素 17对结核病患者中性粒细胞凋亡的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2014,30(8):833-836.

[17] Elbim C,Estaquier J. Cytokines modulate neutrophil death[J].Eur Cytokine Netw,2010, 21(l):1-6.

[18] 王红嫚,薛关生,万义增,等. NF-κB抑制剂PDTC对大鼠急性肺损伤中性粒细胞凋亡的影响[J].中华医院感染学杂志,2012,22(13):2755-2756.

[19] 岳 艳,刘伯毅. TNF-α、IL-1β及中性粒细胞凋亡在妊娠家兔羊水栓塞肺损伤中的作用[J].湖北医药学院学报,2014,33(1):4-6.

[20] Gracie JA,Robertson SE,Mcinnes IB. Interleukin-18[J].J Leukoc Biol,2003,73(2):213-224.

[21] Akhtar S,Li X,Kovacs EJ,etal. Interleukin-18 delays neutrophil apoptosis following alcohol intoxication and burn injury[J].Mol Med,2011,17(1-2):88-94.

[22] 吴彦彦,许兰涛. 白介素-18在急性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用[J].世界华人消化杂志,2012,20(2):140-144.

[23] 刘建辉,孙志平,马玉腾,等. 百草枯中毒致大鼠急性肺损伤时NF-κB抑制剂对中性粒细胞凋亡的影响[J].陕西医学杂志,2009，38(3):282-284.

[24] 贺文成,李 瑾,周 瑞,等. 5-ASA对TNBS结肠炎大鼠血中性粒细胞凋亡及血清IL-8水平的影响[J].世界华人消化杂志,2009,17(13):1297-1302.

[25] 陶 博,辛庆锋,胡建鹏. 奥曲肽对急性胰腺炎患者外周血中性粒细胞凋亡和炎症因子的影响[J].中外医学研究,2017,15(1):52-53.

[26] 闫艳梅,唐亚平,贺 涛,等. 1,25(OH)2D3对2型糖尿病伴牙周炎患者中性粒细胞凋亡及炎性介质表达的影响[J].口腔医学研究,2017,3(33):269-272.

[27] 孙发律,李会朋,滕勇生,等. 大鼠骨髓间充质干细胞联合大承气汤对重症急性胰腺炎模型大鼠的保护作用及机制[J].世界华人消化杂志,2015,23(26):4167-4176.

[28] 田 伟,武 飚,张 章,等. 重症急性胰腺炎大鼠外周血中性粒细胞凋亡的变化及乌司他丁的干预作用[J].中国药物与临床,2014,14(6):732-735.

[29] 秦开秀,李醇文,方 艳,等. 百草枯对活性氧类物质的产生和中性粒细胞凋亡的影响[J].中国应用生理学杂志,2015,31(2):111-114.

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.034

R392.1

A

1000-484X(2017)12-1907-04

①本文为吉林省教育厅科学技术研究项目(2014201)、北华大学省级大学生创新项目(2016-199100282)和北华大学博士启动基金项目(199500031)。

孙晓红(1968年-)，女，博士，副教授，主要从事分子病原学及免疫学方面的研究,E-mail:sunxiaohong68@126.com。

及指导教师：安思训(1969年-),男,副教授,主要从事应用解剖学方面的研究，E-mail:649588687@qq.com。

[收稿2017-09-13 修回2017-10-23]

(编辑 张晓舟)