猪圆环病毒2型高滴度培养方法的研究进展

张海洋 吕超超 肖 燕 孙进忠

（普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471003）

猪圆环病毒2型高滴度培养方法的研究进展

张海洋 吕超超 肖 燕 孙进忠

（普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471003）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）流行广泛，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，还与皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、仔猪传染性先天性震颤等多种疾病相关，严重影响养猪业的健康发展。疫苗能有效防治PCV2，减少病毒对猪群的损害。但PCV2在细胞的增殖滴度普遍不高，制约着疫苗的品质及成本。通过对目前国内外市场上PCV2全病毒灭活疫苗的制备工艺及相关报道进行分析，发现通过刺激细胞或改造和筛选细胞促进PCV2在细胞上的高效增殖，在PCV2疫苗的制备中具有良好的应用前景。

猪圆环病毒2型 高敏感细胞 培养

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是直径为17 nm的无包膜病毒，包含1.76 kb单链环形DNA基因组。PCV有PCV1和PCV2两种血清型，其中PCV1于1974年首次从猪肾传代细胞系PK15中分离[1]，1982年确定为PCV[2]，即后来的PCV1；PCV2于1997年从加拿大西部患有断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的猪群中分离[3]，该病毒与PCV1相似，但具有致病性，后经测序表明其与PCV1在基因结构上存在一定差异，因此命名为PCV2。随后，各国陆续报道该病，2000年我国首次报道用ELISA方法在国内不同年龄段的猪群中检测到PCV2抗体[4]。

PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，还与皮炎肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪繁殖与呼吸综合征、仔猪传染性先天性震颤等多种疾病相关，但临床上以PMWS最为常见[5-7]。目前，PCV2在我国已普遍存在，表现为流行范围广，阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点，严重影响猪群健康，给养猪业造成重大的经济损失。因此，PCV2疫苗的有效使用，对于该病的防控具有重要意义。

目前，国内外商品化的PCV2疫苗有多种，一般为全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。亚单位疫苗是通过杆状病毒或者大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白，在一定条件下形成病毒样粒子（virus-like particles，VLPs）制备而成，免疫猪只后可以对PCV2产生较好的免疫力。较全病毒灭活疫苗，亚单位疫苗价格相对昂贵，目前市场上使用范围较广的多为全病毒灭活疫苗，全病毒灭活疫苗的生产主要采用猪肾细胞系PK15培养，但以PK15细胞培养的PCV2病毒滴度一般仅为104～105TCID50/ml[8，9]，免疫荧光染色显示受感染的PK15细胞中仅有20%对PCV2易感[10]。这可能是制约PCV2全病毒灭活苗疫苗开发的技术瓶颈，因此，研究提高PCV2在细胞内增殖滴度的方法成了国内外学者研究的热点和难点，同时也成了PCV2全病毒灭活苗开发需要克服的最大障碍。参阅相关报道，本文将促进PCV2在细胞中高效增殖的两种途径，即刺激细胞促进PCV2增殖，以及改造和筛选细胞促进PCV2增殖进行简要介绍：

1 通过刺激细胞促进PCV2增殖

PCV2适于在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂期的细胞上复制，并且PCV2的复制依赖细胞周期S期表达的细胞蛋白。PCV2在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞中不生长，在传代PK15细胞中生长，但不产生细胞病变，通常需要借助PCR、间接免疫荧光或原位核酸杂交技术来检测。通常在接种PCV2的PK15细胞培养物中加入某些孵育剂，以促进PCV2复制。Tischer等在细胞培养液中加入300mM的D-氨基葡萄糖发现，D-氨基葡萄糖促进PCV2 DNA进入细胞核中，使得病毒基因组参与有丝分裂S期DNA复制过程，从而增加PCV2基因组的复制效率[10]。Misinzo等用甲基-β-环糊精（MβCD）处理可减少细胞膜胆固醇，PCV2感染内皮细胞是通过网格蛋白和小窝蛋白非依赖、肌动蛋白和Rho-GTPase依赖途径进行的，当细胞膜上胆固醇缺失时，PCV2的感染量会有所提高[11]。IL-2可促进各类上皮细胞增殖（由G1期进入S期），增加一定时间内细胞分裂S期宿主细胞的酶以及病毒中间产物合成次数，从而可持续促进PCV2的增殖[12]。另外，刀豆蛋白（ConA）、α干扰素、γ干扰素的处理均可促进PCV2在PK15细胞上增殖[12-14]。

2 通过改造和筛选细胞促进PCV2增殖

细胞克隆是进行病毒学研究的重要手段，它广泛应用于病毒的分离鉴定、增殖及疫苗生产等方面。Marc-145细胞即是通过亲本细胞MA-104细胞系克隆出的猪繁殖与呼吸综合征病毒高敏感细胞系，极大地便利了猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖培养[15]。

高敏感细胞系的筛选也是促进PCV2在细胞高效增殖的一个研究方向。目前，国外已经筛选出这样的细胞系PK15-C1，并通过研究该细胞系的相关特性证实，高敏感细胞系PK15-C1可促进PCV2在细胞上增殖，对用于PCV2体外复制，以及疫苗、诊断相关研究有着重要的作用[16]。国内从PK15细胞中筛选出的PK15-B1高敏感细胞系，通过该细胞系的相关特性研究，也证明了利用高敏感细胞系可促进PCV2的增殖，并且该细胞系稳定性好，IFA检测发现PK15-B1细胞感染PCV2的滴度可达到107TCID50/ml[17]。彭伍平等利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK，初步研究了PCV2在该克隆株上的增殖特性，证明了高敏感细胞系可以促进PCV2在细胞上增殖，病毒滴度最高可达107.0TCID50/ml，这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价PCV2全病毒灭活疫苗[18]。另外，有学者已经从PK15细胞系中克隆出PKKC细胞系，不仅可以促进PCV2在细胞上增殖，病毒滴度可达106.8TCID50/ml，而且会产生细胞病变，更为直观判断病毒滴度，有利于猪圆环病毒2型培养、疫苗开发及体外诊断的研究[19]。

陈福旺选用能够促进细胞增殖的IL-2作为目的基因构建IL-2过表达细胞系，研究表明，无论用高滴度病毒或低滴度病毒接种，PK15-IL-2增加PCV2复制量和滴度均高于对照细胞5-10倍，连续攻毒后，PCV2拷贝数可到1×1010/ml，病毒TCID50为109.0-109.5/ml，证明了通过改造高敏感细胞系也可以促进PCV2在细胞上增殖，有利于猪圆环病毒2型致病机理研究、病毒培养、全病毒灭活疫苗开发以及工业化生产[20]。

3 总结

PCV2在PK15细胞系上增殖病毒滴度不高，难以达到制备全病毒灭活疫苗的要求，一直以来是制约PCV2全病毒灭活疫苗的技术瓶颈。通过在细胞培养过程中添加D-氨基葡萄糖、甲基-β-环糊精、刀豆蛋白、IL-2等，改造或筛选高敏感细胞系均可持续促进PCV2在细胞中复制增殖，提高PCV2的滴度，降低PCV2全病毒灭活疫苗的生产成本及产品质量，进而提高企业的生产效益和竞争力。

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[20]陈福旺.猪瘟病毒感染报告细胞系和猪圆环病毒2型敏感细胞系的建立[D].吉林大学，2016.

∶“公益性行业（农业）科研专项经费（201303046）”

∶张海洋（1983-），男，本科生。

∶孙进忠，高级兽医师，从事兽用生物制品工程技术的研究。