微小RNA和长链非编码RNA作为心脏疾病生物标志物的研究进展

李芳卉、李东泽、张蜀、赵立志综述，曾锐审校

综述

微小RNA和长链非编码RNA作为心脏疾病生物标志物的研究进展

李芳卉、李东泽、张蜀、赵立志综述，曾锐审校

人类基因组中有超过85%的基因转录为核糖核酸（RNA），但只有约2%的基因转录成编码蛋白质的信使核糖核酸(mRNA)，其余均为非编码RNA（ncRNA）。ncRNA根据长度分为短链ncRNA[如微小RNA (miRNA）]和长链ncRNA（lncRNA）。目前研究发现ncRNA可以通过不同的机制调节心脏功能，同时其调节异常与心血管疾病的发生和发展有很大联系。研究显示，循环血中某些ncRNA稳定性良好,其表达水平异常变化与心血管疾病的病程进展密切相关，提示循环血中的ncRNA具有作为心脏疾病生物标志物的潜在价值。故本文对循环血液中miRNA和lncRNA作为心脏疾病生物标志物的进展进行综述。

综述；微RNAs；长链非编码RNA；心血管疾病

非编码RNA（ncRNA） 是指转录组中不编码蛋白的功能性RNA分子，分为两类：短链ncRNA [如微小RNA （miRNA，核苷酸数小于200）]和长链ncRNA（lncRNA，核苷酸数大于200）。近年来，在基因组学中发现，部分ncRNA在人类基因调控中发挥着重要作用，包括心血管疾病的发生和发展[1，2]。研究显示，循环血中某些ncRNA稳定性良好,其表达水平异常变化与心血管疾病的病程进展密切相关，提示循环血中的ncRNA具有作为心脏疾病生物标志物的潜在价值。本文对循环血液中miRNA和lncRNA在心脏发育中的作用及作为心脏疾病生物标志物的进展进行综述。

1 miRNA和lncRNA 概述

1.1 miRNA

miRNA是一类由内源基因编码的在进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，长度约为20～24 nt 。miRNA通过完全或不完全互补配对的方式结合于靶 基因，从而导致靶基因的降解或翻译抑制。人体内已发现2000多个miRNA，调节60%的人类基因[3]。

大多数miRNA在RNA聚合酶II的作用下转录成初级miRNA（pri-miRNA）[4]。在核糖核酸酶III Drosha酶与RNA结合蛋白协同作用下，pri-miRNA加工成为具有茎环结构的pre-miRNA。随后，pre-miRNA由细胞核转运至细胞质，在Dicer酶和辅助因子TRBP协同作用下，pre-miRNA加工成为成熟miRNA双链。双链miRNA在解螺旋酶的作用下分离,一条成为功能性miRNA，另一条被降解。

1.2 lncRNA

lncRNA是长度大于 200 个核苷酸的ncRNA。人类lncRNA数量预计与蛋白质编码基因的数量相似[5]。根据lncRNA 与蛋白质编码基因的位置关系，分为以下几类[6]： （1）基因间 lncRNA；（2）基因内 lncRNA；（3）双向 lncRNA；（4）内含子 lncRNA；（5）正义 lncRNA；（6）反义 lncRNA。

lncRNA通常有较长的序列，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式，可以与靶基因建立核域并且结合蛋白质从而形成RNA-DNA-蛋白质复合物[6]。因此，lncRNA可以通过更多样的机制来抑制或激活基因的表达[7]。lncRNA参与调节多种重要的细胞活动，如基因表达、基因组印记（H19）、招募染色质修饰物、调节X染色体失活（XIST）、蛋白质活性和蛋白质折叠等[8]。

2 miRNA

2.1 miRNA在心脏中的生物学功能

在心脏发育过程中，miRNA动态表达，调整了心脏重要基因的表达水平，在促进心力衰竭，心肌肥厚，纤维化和缺血/再灌注损伤的基因表达变化中起着关键作用[9]。研究发现，Dicer酶基因敲除小鼠血管新生与形成以及心脏发育均受阻。敲除Dicer的小鼠心脏特异性 miRNA 表达普遍下降，小鼠出生后死于扩张型心肌病和心力衰竭[10，11]。这些研究提示miRNA对心血管系统的发育和生理功能的维持方面是必不可少的[12]。

心肌收缩力取决于肌球蛋白重链（MHC）基因的表达。MHC表达从快收缩肌球蛋白（a型）向慢收缩肌球蛋白（b型）的转化是心血管疾病的一个重要标志。miR-208a 和 miR-208b 是心脏特异性表达 miRNA，分别由a-MHC （Myh6） 和b-MHC （Myh7）的内含子编码。奥尔森实验室对miR-208突变型小鼠与野生型小鼠进行比较[13]，得出miR-208通过一种涉及甲状腺激素的机制来特异性增强b-MHC的表达，对心肌肥大信号的表达起着关键作用。

miR-1和miR-133是两个高度保守的、特异性表达于肌肉组织的 miRNA，成簇存在于同一个多顺反子内，参与肌肉形成、心脏发育和心肌肥厚的发生[14]。在心肌肥厚模型中观察到miR-1和miR-133水平的下降[15]。miR-1抑制HAND2的表达，从而抑制心肌细胞增殖，促进心肌细胞分化，减轻心肌细胞的肥大[16]。利用转基因小鼠模型做进一步研究，发现miR-133调节B1肾上腺素能途径的多个组件并且在心力衰竭时起到保护作用[17]。miR-1通过影响钾离子通道亚单位 Kir2.1 和心脏间隙链接通道蛋白Cx43而参与心脏电传导的调节[18]。Vacchi-Suzzi等[19]通过对miRNA测序，研究不同物种（大鼠，狗和猴）的心脏特异性miRNA，确定了心脏特殊结构中的保守miRNA的特征；利用原位杂交技术确认了miR-1，miR-125b-5p和miR-204的表达模式。

2.2 循环miRNA的生物标志物作用

血浆中存在大量的核糖核酸酶（RNAses），当miRNA与血浆结合后就会被迅速降解[20]，然而循环血液中的某些miRNA在一定时间内并不受其影响，仍可保持较好的稳定性和较高的表达量，提示循环血液中测量到的miRNA是通过各种载体而稳定存在的。综合已有的研究分析，循环miRNA可能通过如下途径稳定存在：（1）胞外囊泡根据大小，胞外囊泡被分为外泌体 （Exosomes） 和微泡 （Microvesicles） 。胞外囊泡的成分包括DNA、mRNA、ncRNA、蛋白质和脂质。当外周环境变化时，胞外囊泡的成分也会发生相应的改变[21]。胞外囊泡通过交换信号分子来介导细胞间的通信。（2）蛋白质复合物：对体液miRNA进行超速离心法纯化后发现，部分miRNA通过形成miRNA-蛋白质复合物而免遭破坏。进一步研究得到，miRNA-蛋白质复合物的形成与argonaute-2（Ago2）酶有关[22]。近期研究表明，miRNA可以主动或被动地从细胞中释放。

对不同类型心脏病患者的血液进行检测，所得出miRNA的含量水平有所不同。对急性心肌梗死（AMI）中心脏特异性循环miRNA进行研究显示，AMI患者心肌梗死后1 h内，血浆miR-208a水平升高；4h内，血浆miR-1、miR-133和miR-499水平升高；但在健康对照组、肾梗死患者组、与非AMI胸痛患者组的血浆中未发现升高[23]。因此，miR-208a是一个具有高度灵敏性和特异性的AMI生物标志物。对miR-208b进行研究，显示其在AMI患者血浆中增加了1600倍[24]。在对AMI患者进行了3个月的治疗后，miRNA峰值发生逆转，下降至低于检测极限[25]。以上研究结果表明miR-1, miR-133a, miR-499, miR-208a和miR-208b具有作为心血管疾病心肌损伤的生物标志物的潜能。

3 lncRNA

3.1 lncRNA在心脏中的生物学功能

虽然对lncRNA功能和作用机制的研究尚处于起步阶段，但已有的一些研究提示lncRNA作为一种新的生物调节模式与心血管疾病有着密切的联系。

心脏发育研究表明，胚胎在不同发育阶段lncRNA的表达存在较大差异，很可能是参与正常心脏发育的新机制[26]。在中胚层发现并与小鼠心脏发育相关的两个lncRNA—— Bvht（brave heart）和 Fendrr（Foxf1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA）显现出尤为重要的作用。Bvht在小鼠胚胎干细胞和新生小鼠心肌细胞中高度表达。利用核糖核酸干扰（RNAi）对小鼠胚胎干细胞中Bvht进行敲除，发现Bvht的缺失影响了心肌特异性基因的表达，改变了心肌细胞的发育。Fendrr是一个侧中胚层特异性的lncRNA，控制着中胚层的分化，通过连接组蛋白重构复合体PRC2和TrxG/MLL使其分化成为心脏和体壁[27]。对胚胎细胞中Fendrr进行完全敲除，出现由于心脏功能损伤导致胚胎致死的现象，同时会影响体壁的发育。进一步的机制研究发现，Fendrr在表观水平调控许多重要基因的表达，例如GATA-6、PRC2等[26]。

几个全基因组研究证实了lncRNA和心血管疾病之间的其他联系。lncRNA心肌梗死相关转录本（MIAT）的改变与心肌梗死的易感性有关[28]。心肌细胞凋亡相关lncRNA（CARL）通过“海绵”作用与miR-539结合和分离抑制线粒体分裂和凋亡改善心肌缺血-再灌注损伤后的心肌梗死。 INK4 基因座反义lncRNA（ANRIL）与动脉粥样硬化性血管病敏感性有关[29]。另外，ANRIL离体敲除系统表示ANRIL在葡萄糖和脂肪酸代谢调控基因的表达中起着重要的作用[30]。肌球蛋白重链相关RNA转录子（Myheart或Mhrt）位于心肌细胞核，并在心脏负荷过程中调节病理性心肌肥大和心力衰竭[31]。心肌肥厚相关因子（CHRF）可以作为一个“分子诱饵”或“miRNA海绵”来隔绝miR-489，其中包括对靶点髓样分化初始应答基因88（Myd88）进行转录抑制，调控心肌肥厚。

3.2 循环lncRNA的心脏生物标志物作用

lncRNA可能以胞外囊泡或蛋白质复合物形式进入人体循环系统中，形成循环lncRNA稳定而广泛存在于体液中。新近研究发现，lncRNA的表达具有组织特异性，可作为心血管疾病早期诊断的生物标志物。

Kumarswamy等[32]对有/无左心室重塑患者血浆样品中的lncRNA进行筛查，发现lncRNA uc022bqs.1 （LIPCAR）是心肌梗死后心肌重塑的相关因素。慢性收缩性心力衰竭患者血浆中LIPCAR异常表达，且与其心血管病死率密切相关，可以作为一种新型的心肌重塑标志物。另一项研究使用PCR技术量化了心肌梗死患者全血样本中五种lncRNA（aHIF，ANRIL，KCNQ1OT1、MIAT，MALAT1）的水平[33]。显示，除MIAT失调外，aHIF、KCNQ1OT1和MALAT1增加，ANRIL减少。lncRNA的表达谱在ST段抬高型和非ST段抬高型心肌梗死患者之间也有所不同。

Yang等[34]对进展型心衰和行支架手术的左心室组织进行研究，发现其基因转录本异常表达，并且与mRNA和miRNA不同的是，lncRNAs的表达可以区别不同原因所致的心力衰竭，在行支架手术后的组织中异常表达更明显。

Xu等[35]采集了20 例心房颤动患者的血液样本，应用人类 lncRNAs 阵列进行分析，发现有153个miRNA 和177个lncRNAs差异性表达，其中lncRNAs NONHSAT040387 上调和 NONHSAT098586下调最为显著，应用 GO 和 KEGG 信号通路分析，对lncRNAs NONHSAT040387 和 NONHSAT098586在心房颤动的调控功能做进一步探索，结果发现蛋白质异源二聚体活性和氧转运体活性可能参与心房颤动发病机制，但与这两个 lncRNAs 表达和功能的关系有待进一步研究。

以上研究均表明lncRNA在心血管疾病的发病机制中有着重要的作用，但是其具体的作用机制还需进一步的研究来阐明。

4 总结与展望

循环microRNA水平与人类心血管疾病的关联很大，但是循环lncRNA作为生物标志物的研究才刚刚起步。目前对于ncRNA功能研究方法学较为成熟，能够对其在心血管疾病中的功能进行系统研究，但是作为生物标记物，需要更多的大样本临床研究进行验证，同时能否解决循环中ncRNA的快速检测等问题，也将影响ncRNA作为心血管疾病诊断和评估预后的高效生物标志物的临床运用。

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2017-04-06）

（编辑：王宝茹）

四川省卫生和计划生育委员会科研项目（16PJ305）；泸州-西南医大联合基金项目（2016LZXNYD-J04）

610041 四川省成都市，四川大学华西临床医学院华西医院 急诊科（李芳卉、李东泽、张蜀），心脏内科（曾锐）；西南医科大学第二附属医院 心脑病科（赵立志）

李芳卉 住院医师 学士 主要从事心血管疾病基础和临床研究 Email: 551801146@qq.com 通讯作者：曾锐 Email:zengrui_0524@126.com

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1000-3614（2017）11-1131-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.024