HCN通道在中枢神经系统的功能和调节机制研究进展

翁谢川

（军事医学研究院1.军事认知与脑科学研究所，2.国家蛋白质组学重点实验室，北京 100850）

超极化激活的环核苷酸门控（hyperpolarizationactivated and cyclic nucleotide-gated，HCN）阳离子通道是一类新近发现的由HCN1-4基因家族编码的离子通道［1］。不同于经典的去极化激活的Na+通道和K+通道，HCN通道在膜电位超极化时开放，其在中枢神经系统的功能和角色倍受关注。

HCN通道对K+和Na+具有通透性，其离子通透比率为3～5∶1，其反转电位在-30 mV左右［1］。HCN通道需要细胞外有Cl-和K+存在时才能开放。有趣的是，在HCN通道的C末端有一个环核苷酸结合域（cyclic nucleotide-binding domain，CNBD），称为C-linker，在HCN通道的调节中发挥重要作用。C-linker可通过结合环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）等信号分子诱导HCN通道的电压依赖曲线右移，从而使HCN通道更容易开放［2-4］。因此，HCN通道电流也被称为“有意思的电流（funny current，If）”或“奇怪的电流（queer current，Iq）”。HCN 通道在神经系统中的功能和角色与它的这些电生理特征紧密相连［5］。本文重点探讨HCN通道在神经系统的生理功能和作用、调节因子及其作为新药靶点可能的临床意义。

1 HCN通道蛋白家族

HCN通道于20世纪70年代在窦房结细胞和神经元中被发现和鉴定，由4个相同的亚基组成聚合体（homomeric）或由4个不同的亚基构成复合体（heteromeric）［6］。在哺乳动物中，HCN 通道家族包含HCN1，HCN2，HCN3和HCN4 4个亚单位，亚单位之间序列的同源性约为60%。每个亚单位都有6个跨膜区，跨膜区包括6个α-螺旋（S1～S6），其中S5和S6螺旋区域负责离子的选择性通透，带正电的S4螺旋区域为电压感受器［7］。

虽然HCN通道4个亚型介导的电流互不相同，但依据其激活的动力学特征，它们激活的速度都具有强烈的电压依赖性，其激活速度HCN1＞HCN2＞HCN3＞HCN4。另外，HCN通道4个亚型对cAMP，cCMP 和 cGMP的敏感性也存在差异［2，4］。例如，cAMP能使HCN2和HCN4的激活曲线右移+15 mV，而对HCN1和HCN3的调节作用却很弱［4］。可以想象的是，不同亚基构成的HCN通道，其生物物理特性由每个亚单位共同确定，而这种通道的构成方式对于不同类型神经元中HCN电流的多样性具有重要意义。

2 HCN通道在神经系统中的表达模式

HCN通道主要在大脑和心脏中表达。近年来，在味蕾、胰腺细胞、睾丸、平滑肌、内耳和肾等组织中也发现有HCN通道蛋白的存在，其功能和角色作用还不清楚［5，8-12］。在大脑中，HCN2亚型的表达最为普遍，几乎存在于所有的脑内核团；而HCN1在大脑皮质、海马和上丘中表达最为丰富［13］。HCN3的表达多见于嗅球、下丘脑核团和视网膜。HCN4主要在丘脑核团、基底神经节、嗅球及大鼠脊髓和海马的快速放电的中间神经元中表达［10，14］。

在神经元，HCN通道存在于树突、胞体和轴突的末端，其在神经元表面表达的密度不尽相同［1］。例如，HCN通道在丘脑网状神经元远端树突的表达比在胞体丰富，而在丘脑皮质的中继神经表面的分布几乎是均匀的。在成熟大鼠大脑皮质的V层锥体神经元中，HCN1在树突中表达丰富，而HCN2主要表达在神经元的胞体［15］。

本课题组近期发现，HCN1，HCN2和HCN3在各种类型的感觉神经元上均有表达，与文献报道一致［5，11，16-17］。RT-PCR 和免疫组化证实，HCN1，HCN2和HCN3共存于正常大鼠的脊髓背根神经节（dorsal root ganglions，DRG），主要在大型神经元上，其中HCN1是表达最为丰富的亚型。

HCN1和HCN2通道蛋白在伤害性感觉神经元和低阈值的机械感觉神经元中都有表达，这可能与其参与神经的传导速率相关［11］。HCN1和HCN2通道蛋白水平在非伤害性感觉神经元中的高表达，可能与其参与DRG传导非疼痛性刺激相关。对比DRG中的其他神经元，HCN2较HCN1更高表达于肌梭传入神经元（muscle spindle afferents，MSA）［5］，该结果与MSA中记录到的大的HCN电流相一致。而在正常大鼠的C纤维伤害性感觉神经元，HCN1和HCN2通道蛋白的表达水平较低，其HCN电流比较小，甚至低于一些低阈值的C纤维神经，尽管伤害性感觉神经元中的HCN2在慢性疼痛中发挥着非常重要的角色［6，11］。

3 HCN通道在慢性疼痛中的重要作用

越来越多的证据表明，HCN通道在炎性和神经病理性疼痛中扮演重要角色［5-6，11，16，18］。利用在体胞内技术记录正常大鼠和弗氏完全佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）诱导的后肢炎性痛大鼠L4/L5的DRG神经元，本课题组发现，负责伤害性感觉的C纤维神经元而不是Aδ纤维神经元兴奋性增强，其HCN通道电流幅度显著增加［5］。免疫组化实验进一步发现，HCN通道电流的增大与HCN2而不是HCN1和HCN3的表达上调相关。其他研究也证实了小型神经元中的HCN2在皮肤炎症1 d后表达即开始上调，而大型神经元中的HCN2表达在炎症4 d后下降。因此，HCN2在炎性疼痛中发挥重要的角色［11］。

在部分神经损伤的模型中，尽管HCN电流Ih增大，但HCN1和HCN2通道mRNA和蛋白表达却降低，而HCN3和HCN4的表达未发生变化，因此说明HCN通道还存在转录后的调节机制［1］。研究发现，在神经根型颈椎病模型中，大鼠坐骨神经损伤后Aδ而非Aα/β神经元Ih电流增加。在这个模型中，通过插入不锈钢棒进入椎间孔的L4和L5直接进行DRG的慢性压迫，5～7 d后进行疼痛的行为学和电生理测试。从伤害性神经元中敲除HCN2亚型可以消除热诱发炎性疼痛和神经病理性疼痛的症状，但急性疼痛感觉不受影响［6，18-19］。另外，神经药理学研究发现，HCN通道选择性拮抗剂ZD7288可以显著逆转慢性疼痛中痛觉过敏、痛觉超敏和自发性疼痛的症状［1，5］。以上研究表明，HCN 通道在慢性炎性疼痛和神经病理性疼痛中具有重要功能，选择性HCN通道阻断剂可能成为有价值的镇痛药。

4 HCN通道参与部分脑疾病的发生

中枢神经系统是由神经细胞构成的错综复杂的网络，具有多种电学特性。对于一个特定的神经元，细胞HCN电流大小和动力学的增加或减少可能对大脑功能、兴奋性或抑制性产生不同的影响，这取决于神经元的内在特性及其在大脑信号整合背景下的角色［20］。在大脑中，HCN通道的表达和动力学特征的改变与癫痫、失神发作、帕金森病、抑郁症及一些环境刺激等病理疾病紧密相关［1，21-24］。例如，在毛果芸香碱诱导的癫痫持续性抽搐状态中，HCN通道蛋白在膜表面表达，但在随后1周内，HCN通道蛋白和mRNA表达降低，其电压依赖性也在癫痫病中发生改变［17-18］。

感觉传入是增加或保持HCN通道表达水平的必要条件。研究发现，胡须剥夺实验减少了大鼠躯体感觉皮质树突HCN通道的表达［7］。在同一癫痫模型中，HCN2在海马CA3区增加，而在海马CA1区HCN1和HCN2通道蛋白减少［25-26］。研究还发现，在社交冲突模型和慢性不可预见性轻度应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）所致的抑郁模型中，HCN通道蛋白表达上调且Ih电流增大，而ZD7288能有效治疗抑郁的发生，表明HCN参与了抑郁症的发生［24］。另外，近期研究发现，HCN通道还参与了甲基苯丙胺成瘾的发生。这些研究表明，HCN通道广泛参与了大脑疾病。然而，HCN通道表达的调控机制仍然需要进一步的探讨［26-30］。

5 HCN通道参与神经系统疾病的机制

5.1 HCN通道对神经兴奋性的调节

HCN通道参与神经系统疾病的发生与其对神经元兴奋性的调节直接相关。由于典型的HCN通道电流反转电位约为-30 mV，高于动作电位产生的正常阈值，HCN通道电流控制膜电位在静息膜电位附近［7］。当移除HCN通道的电导，模拟神经元显示超极化膜电位。例如，阻断HCN通道可以诱导大鼠上丘神经元的超极化［1］。虽然HCN通道电导降低了兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）振幅，但这种抑制效应被膜电位的去极化作用所掩盖［7］。此外，HCN通道减弱抑制性突触输入的影响，因为抑制性突触超极化电导可以打开HCN通道，唤起极化电导［6-7］。当电压依赖的HCN通道被cAMP或者磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）调节时，通道在静息膜电位附近即可激活，并可作为一个兴奋因子［2］。而且，用光纤刺激大鼠的上丘时，树突的HCN通道被激活产生短和固定潜伏期的树突电位［2-3，31］。

一般认为，活化的HCN通道电导可以降低膜电阻。这种降低可以抑制突触输入对膜电位的影响［1，7］。随着HCN通道的激活，突触后电位的振幅和动力参数逐渐变小变短。树突的HCN通道可以使皮质和海马神经元突触输入正常化。HCN通道的密度随着海马和新皮质锥体神经元体细胞的距离的增加而增大［21］。这种树突HCN通道决定着神经元胞体上EPSP振幅的大小，并且抑制海马和新皮质锥体神经元突触输入的位置依赖性［1］。

激活的HCN通道参与了突触输入的过程。由于HCN通道电导通过降低膜电阻而缩短了EPSP的上升时间和衰减时间，因此抑制了在低频时发生的重复EPSP的总和。这种抑制过滤出低频输入，从而提高了同步突触输入的选择性［7］。离子通道的主动电导使神经元产生固有的膜电位振荡和共振。这样的节律性活动可以在一定的频率过滤输入，并能影响峰电位的定时精度［7］。HCN通道电流过滤出慢频输入。有证据表明，在中枢神经系统的特定区域中，Ih电流对神经元同步放电的产生有促进作用［32］，例如在丘脑皮质中继神经元的Ih电流参与了调节睡眠和觉醒状态的活动［14］。需要指出的是，HCN通道的表达必须是赋予细胞有节奏的放电能力，原因在于细胞启动和（或）维持有节奏活动的能力取决于功能上不同类的离子通道的相互作用［7］。

5.2 细胞内信号分子对HCN通道的调节

HCN通道可以被细胞内信号分子调控，包含cAMP，PIP2和三角形四肽重复的相互作用蛋白（tetratricopetide repeat-containing Rab8b-interacting protein，TRIP8b）［2，33-34］。此外，电压门控性钾通道对HCN通道活动有很强的影响［7］。由于这些特性，HCN通道电流可以有广泛的功能，并由一个微妙的平衡调节系统决定。研究证实，背根神经节的许多神经调质如P物质、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、血清素和神经介素U都有增强Ih电流的作用［35］。增加神经元Ih电流可能意味着炎症介质和神经肽产生痛觉过敏的一种新的机制。此外，钙依赖磷酸酶的激活和P38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）的失活参与到电压依赖性的超极化转移中［35］。

有报道显示，一些蛋白质和HCN通道蛋白一起组装，其功能意义尚不清楚。这种蛋白质包括电压门控性钾通道蛋白、Isk相关的家庭成员2、钾通道调节器1、细丝蛋白A（filamin A）、肠抑胃肽（gastric inhibition polypeptide，GRP1）相关的支架蛋白以及小窝蛋白-3（caveolin-3）等。这些蛋白质在HCN通道功能方面的具体作用有待进一步研究验证。

除了辅助亚基，HCN通道也被几个小分子质量因子调控［6］。这些因子中最典型的是PIP2，它能使HCN通道的激活曲线右移约+20 mV。这个调节是非常重要的，因为它需要在生理电压范围内激活HCN通道。除了PIP2，一些其他酸性脂类如磷脂酸和花生四烯酸，它们是二酰甘油激酶-磷酯酶A2信号转导通路的产物，能促进HCN通道的激活。HCN通道活动也受细胞外的K+、Cl-浓度和细胞内外的H+浓度的调节。

第三组HCN 通道调节器包括蛋白激酶［6，35］。酪氨酸蛋白激酶可以直接与HCN1，HCN2和HCN4相互作用，并通过磷酸化的酪氨酸来调节Ih电流。酪氨酸蛋白激酶在生理条件下对HCN通道的调节作用在大鼠窦房结起搏细胞和神经元都得到了证实。P38 MAPK能上调海马锥体神经元中HCN通道的表达，而钙依赖磷酸酶能通过诱导激活曲线超极化偏移来抑制海马锥体神经元中HCN通道［1，6］。而P38 MAPK和钙依赖磷酸酶的这种双向调节是由HCN通道直接的磷酸化或去磷酸化还是由其他蛋白机制引起［36］，还有待进一步确定。cGMP依赖性蛋白激酶2已被确定为HCN通道在大脑中的另一个调节因子。它结合到HCN2 C末端并且磷酸化CNBD的一个特定丝氨酸残基［37］。该修饰使激活曲线向超极化方向偏移。因此，cGMP通过2种方式来调节HCN通道活动：①直接结合到通道蛋白的CNBD来增强HCN电流；②磷酸化CNBD抑制通道的开放。

6 HCN通道未来的临床意义

HCN通道可以在兴奋和抑制2种状态下工作，并且这种作用通过药理学调节来修饰。因此，HCN通道是潜在的治疗脑部疾病的理想靶标。

影响Ih的药物常被称为减慢心率药，常被用来研究HCN通道的功能［1，25］。由于对cAMP敏感，β受体阻滞剂主要影响HCN2和HCN4，但其他减慢心率的药物对HCN通道并没有特定的选择性。一些药物包括ZD7288、烯丙尼定（alinidine）、扎替雷定（zatebradine）和伊伐布雷定（ivabradine）［5，38-40］，这些药物已被用来治疗心动过速。

本课题组研究表明，对CFA诱导的慢性炎性疼痛模型大鼠和神经损伤模型大鼠，HCN通道阻断剂ZD7288具有明显的减轻疼痛和反转慢性疼痛症状的作用。另外，其他临床常用的镇痛药也被证明可能是通过调节HCN通道功能而发挥镇痛效果［6，19，39］。例如，一些局麻药曾被认为是通过阻断电压门控钠通道来发挥作用，但其对钠通道并无高选择性，可能还存在其他药理作用机制［38］。全身给予利多卡因（lidocaine）对神经病理性疼痛有效，其有效剂量下血浆利多卡因浓度与其抑制心肌细胞HCN通道电流的IC50接近，但比其作用于钠通道的IC50低得多［40-41］。虽然尚不足以断定利多卡因治疗疼痛与其抑制Ih电流相关，但利多卡因对HCN通道的抑制作用可能强于其对钠离子通道的抑制作用。

总之，由于HCN通道在神经系统重要的功能及其对神经元兴奋性调节的重要性，已成为慢性疼痛及一些脑疾病的潜在治疗靶点。一些临床使用的药物将为我们HCN通道亚基选择性拮抗剂提供线索。此外，HCN通道在神经系统的功能和相关机制仍有待进一步阐明。

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