抗肌萎缩蛋白亚型Dp140的研究进展

牛亚运，董玉茹，吴士文

抗肌萎缩蛋白亚型Dp140的研究进展

牛亚运，董玉茹，吴士文

Duchenne型肌营养不良是由抗肌萎缩蛋白基因缺陷所导致肌营养不良，在中枢神经系统中至少存在6种抗肌萎缩蛋白亚型。Dp140主要在脑中表达，与认知功能损害密切相关。本文概述Dp140的发现、结构、抗肌萎缩蛋白基因定位、检测方法及功能等。

Duchenne型肌营养不良；抗肌萎缩蛋白；Dp140；综述

[本文著录格式]牛亚运，董玉茹，吴士文.抗肌萎缩蛋白亚型Dp140的研究进展[J].中国康复理论与实践,2017,23(3): 308-310.

CITED AS:Niu YY,Dong YR,Wu SW.Progress of dystrophin isoform Dp140(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017, 23(3):308-310.

Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是一种X连锁隐性遗传性肌病，主要表现为进行性肢体力弱、认知功能损害，晚期往往因为循环及呼吸功能衰竭而死亡[1]。

DMD是由抗肌萎缩蛋白基因突变所致。抗肌萎缩蛋白基因位于Xp21，是人类最大的基因之一，长度超过2.5 Mbp，占整个人类基因的0.1%。该基因有79个外显子，编码产生抗肌萎缩蛋白。

抗肌萎缩蛋白由三个部分组成：N端为肌动蛋白结合域，中段为棒状区——24个血影蛋白样三螺旋结构，C端为半胱氨酸富集区。C端作为桥梁使抗肌萎缩蛋白和一组分别位于细胞外(α-dystroglycan)、细胞膜(sarcoglycan和β-dystroglycan)及细胞质(syntrophin和dystrobrevin)的蛋白组成抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合体(dystrophin-associated protein complex,DAPC)。DAPC将细胞外基质与细胞骨架连接在一起，使肌细胞膜在肌肉收缩时保持结构稳定，并能调节质膜的信号转导。抗肌萎缩蛋白基因突变引起抗肌萎缩蛋白缺乏，导致DAPC结构残缺而被破坏，最终引起进展性肌肉无力[2]。

抗肌萎缩蛋白基因的表达由至少7个启动子调控，其中3个上游启动子可调控表达全长的抗肌萎缩蛋白亚型Dp427(主要分布于肌肉，在脑中也有表达)，4个内部启动子可调控表达较小的亚型，根据分子量分别命名为Dp260(主要在视网膜表达)、Dp140(主要在脑、肾和视网膜表达)、Dp116(主要在婴儿脑和成人的周围神经表达)、Dp71(除了肌肉，在各组织中广泛表达)和Dp40(在脑中表达)[1,3-8]。

近来研究发现，Dp140缺乏与认知功能损害相关，Dp140在神经系统中的作用受到人们更多的重视。

1 Dp140的发现

1995 年，Lidov等利用多克隆亲和纯化抗体对B10小鼠(抗肌萎缩蛋白正常表达)和mdx小鼠(exon23发生点突变致Dp427表达缺陷，而所有较小的抗肌萎缩蛋白亚型正常表达)的脑组织进行免疫印记分析，均发现一长度为140 kDa的蛋白；另外在肾脏中也发现了这一蛋白，而在骨骼肌、心肌、肺、肝和脾中未发现。这些研究者对mdx 3cv小鼠(exon65/66发生剪接突变导致所有抗肌萎缩蛋白亚型表达缺陷)的脑组织进行Western blotting分析，这一长度140 kDa的蛋白在嗅球和海马都缺乏，表明该蛋白是抗肌萎缩蛋白亚型，而非交叉反应产生的蛋白，并将其命名为Dp140[4]。1997年，Rodius等[9]确认Dp140在视网膜中也有表达。

2 结构及基因定位

Koenig等[10]对抗肌萎缩蛋白的结构进行分析发现，在中间棒状区的24个重复区段(24个血影蛋白样三螺旋结构)中，散在分布着4个非重复区段(即铰链)，其中区段1(75aa)位于N端区和第1重复区段之间，区段4(72aa)位于第24重复区段与半胱氨酸富集区之间，区段2(50aa)位于第3和第4重复区段之间，区段3(47aa)位于第19和第20重复区段之间。Dp140缺乏结合肌动蛋白的N端结构域及棒状区的近段部分，但包含靠近远端的5个重复区段及抗肌萎缩蛋白的C端区域，其中含有一段完整的铰链区域。

Lidov等利用鼠嗅球cDNA库和互补探针杂交技术，发现Dp140 cDNA的5'端部分序列与抗肌萎缩蛋白基因的exon45相同，且Dp140的第一外显子与exon45毗邻。通过对exon44缺失的患者进行基因序列分析，推测Dp140的第一外显子位于intron44[4]。这一假设在后续的研究中得以证实。通过对Dp140第一外显子5'端一长度为3.4 kb序列测序后发现，这一序列包含2个多态CA重复区段及一侧翼序列，最终将Dp140的第一外显子定位于intron44[11]。

Dp140的第一外显子和exon45之间没有蛋氨酸密码子，Dp140的翻译起始位点出现在第19和第20重复区段之间的铰链3区域；而后进一步确定Dp140第一个框内ATG翻译起始位点出现在exon51[4]。

3 检测方法

人们对Dp140的研究由来已久，在应用二代测序确定抗肌萎缩蛋白基因的突变情况后进一步对Dp140进行确认。然而，对于Dp140表达是否存在缺陷的评定尚没有统一的标准，目前常用的检测方法如下。

3.1检测Dp140第一外显子

Lidov等[4]利用针对Dp140第一外显子的正向引物和反向引物进行PCR扩增来确定Dp140第一外显子存在与否。Moizard等应用同样的方法对49例DMD患者进行检测，在一例exon18-44缺失和一例exon44缺失的患者中，未检测到Dp140第一外显子的存在[12]。

3.2检测Dp140启动子区域的完整性

Kochling等[13]应用微卫星IVS44SK21和IVS44SK12检测Dp140启动子区域的完整性。Bardoni等[14]应用这一方法对断裂点发生在exon44 3'端，同时Dp140第一外显子仍然保留的患者进行研究，发现这些患者均保留Dp140的启动子区域。

3.3利用抗肌萎缩蛋白基因突变位置预测

Wingeier等[15]的研究以intron44中的启动子区域和/或编码区域(从exon51起始的远端序列为编码区)任何部分缺失，判定Dp140表达受到影响，Dp140的5'端非编码区发生缺失突变也判定为Dp140表达受到影响。但D'angelo等[16]将突变发生在或扩展至exon45-55认定为影响Dp140表达，而突变发生在exon44上游则被认定Dp140表达未受影响。Doorenweerd等[16]将突变发生在intron44的上游认定为Dp140表达，突变涉及exon51或其下游则被认为Dp140不能表达。抗肌萎缩蛋白基因缺失位置的3'端断裂点发生在Dp140启动子及第一外显子的上游认定为Dp140表达，断裂点发生在intron44与exon51之间，认定其间序列为Dp140 5'端非编码区，无法确定Dp140是否表达[8]。

4 功能

4.1在脑中的作用

Dp140主要在脑中表达。目前对Dp140在脑中的作用主要集中在Dp140与认知功能损害关系的研究上。在DMD患者中，约1/3存在非进展性认知功能损害，这些患者的平均智商较年龄匹配的正常人平均约低1~1.5个标准差[17]。一项721例DMD患者的Meta分析显示[16]，DMD患者平均总智商(full scale intelligence quotient,FSIQ)为82，其中19%~35%低于70，3%低于50。

4.1.1认知功能

1992 年，Bushby等[18]发现抗肌萎缩蛋白基因3'端缺失较5'端更易出现智能缺陷。Tokarz等[19]发现Dp140在胎儿脑中表达，推测Dp140表达缺乏可能与DMD认知功能损害有关。Moizard等[12]对49例DMD患者进行分析，发现突变影响Dp140表达的患者认知功能评分偏低。Bardoni等[13-14]的研究表明，Dp140启动子区域或编码区的突变与认知功能损害明显相关，强调Dp140在DMD相关性认知功能损害中的潜在作用。Taylor等[7]对62例DMD患者进行研究，发现与突变发生在Dp140非编码区的患者相比，在Dp140启动子和或编码区突变患者的认知功能损害更加明显。

4.1.2语言智商(verbal intelligence quotient,VIQ)

许多研究将VIQ和操作智商(performance intelligence quotient,PIQ)进行对比，大多数研究表明[20]，DMD患者VIQ损害较PIQ更为明显。Moizard等[12]发现，突变分别发生在抗肌萎缩蛋白基因的近端和远端患者的PIQ无显著性差别，在VIQ< 70的患者中，绝大部分突变位置发生在远端。但D'angelo等[16]的研究显示，突变分别发生在抗肌萎缩蛋白基因近端和远端患者的VIQ均较低，远端突变患者的PIQ较近端低。更加详细的神经心理评定表明，远端部分突变患者存在更为明显的口语短时记忆、视觉记忆、视空间结构、逻辑顺序、句法处理等障碍，认为Dp140表达缺乏与总体语言功能缺陷明显相关，并推测这与视空间能力、口语与视觉记忆能力、句法处理能力方面的缺陷有关。

4.1.3其他

Doorenweerd等[8]对30例DMD患者进行头颅磁共振弥散张量成像研究，发现Dp140表达缺乏患者的部分各向异性指数(fractional anisotropy,FA)较低，径向弥散系数(radial diffusivity, RD)较高，提示Dp140在脑发育中的重要作用。他们[21]又对33例DMD患者进行脑血流分析发现，Dp140表达缺乏患者的脑血流明显偏低。由于Dp140在与周细胞相关的星形胶质细胞终脚和微血管表达[22]，而周细胞与血管舒张有关[23]，提示Dp140在调节血管舒张中发挥一定作用。

4.2在视网膜中的作用

除了Dp116，所有抗肌萎缩蛋白亚型在视网膜中均有表达。具体来说，Dp427、Dp260和Dp140在光感受器中表达，Dp71在Müller胶质细胞中表达。最近的研究又将Dp427、Dp260和Dp140的表达精确到视网膜的内核层细胞[24]，其中Dp427在视锥细胞中的表达较视杆细胞多，在双极细胞和无长突神经细胞中也有所表达。

Barboni等[25]对19例DMD患者和7名携带者，应用全视野视网膜电流图(full-field flash electroretinogram,ERG)检查视网膜功能，发现exon30下游序列发生突变时，引起Dp427、Dp260和Dp140表达异常，进而导致暗适应(视杆细胞发挥作用)ERG发生改变，而exon30上游序列发生突变时，将会引起明适应(视锥细胞发挥作用)ERG改变。

关于Dp140缺乏对视网膜的影响，许多研究探索的是Dp140及其他一种或几种抗肌萎缩蛋白亚型均缺乏时，视网膜发生的电生理变化。虽未进行专门的探讨，但是我们可以推测Dp140表达改变可能与视网膜电生理相关。

Dp140的基础研究集中在早期，近年来的研究偏重于临床。根据患者抗肌萎缩蛋白基因突变位置，预测Dp140表达，为评估患者认知功能及神经心理发育可能出现的问题提供依据，指导患者的生活及学习，改善生活质量。

对Dp140表达准确而简捷的评估方法有待进一步研究，以便应用于临床。Dp140表达缺乏对神经心理的影响，也需要深入探讨。

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Progress of Dystrophin Isoform Dp140(review)

NIU Ya-yun,DONG Yu-ru,WU Shi-wen
General Hospital of ChineseArmed Police Forces,Beijing 100039,China

WU Shi-wen.E-mail:wu_shiwen@yahoo.com

Duchenne muscular dystrophy is the most prevalent muscular dystrophy caused by dystrophin gene mutations.In the central nervous systerm,there are at least six dystrophin isoforms,in which Dp140 is closely associated with cognitive impairment.This paper reviewed the discovery,structure,gene location,detection methods and function of Dp140.

Duchenne muscular dystrophy;dystrophin;Dp140;review

R746.2

A

1006-9771(2017)03-0308-03

2016-12-19

2017-02-21)

首都临床特色应用研究与成果推广项目(No.Z151100004015025)。

中国人民武装警察部队总医院，北京市100039。作者简介：牛亚运(1990-)，女，汉族，山东莱州市人，硕士研究生，主要研究方向：神经肌肉病。通讯作者：吴士文(1970-)，男，汉族，江苏泗阳市人，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：神经肌肉病和热射病。E-mail:wu_shiwen@yahoo.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.012