缺氧诱导因子-1α在缺血性脑卒中模型中介导神经干-祖细胞作用机制的研究进展

张东圆，李明，王正则，张文冉，许晓丹，张丽莹，田沈

缺氧诱导因子-1α在缺血性脑卒中模型中介导神经干-祖细胞作用机制的研究进展

张东圆，李明，王正则，张文冉，许晓丹，张丽莹，田沈

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是一种缺氧应答因子。脑缺血缺氧时，HIF-1α表达上调，调控下游基因表达，对脑缺血后能量代谢障碍的改善以及微循环的建立具有重要意义。神经干-祖细胞的再生能促进脑梗死的功能恢复。HIF-1α可能通过Notch通路、Wnt/β-catenin通路等机制，介导神经干-祖细胞增殖、分化。

缺血性脑卒中；缺氧诱导因子-1α；神经干-祖细胞；综述

[本文著录格式]张东圆，李明，王正则，等.缺氧诱导因子-1α在缺血性脑卒中模型中介导神经干-祖细胞作用机制的研究进展[J].中国康复理论与实践,2017,23(3):319-322.

CITED AS:Zhang DY,Li M,Wang ZZ,et al.Mechanism of neural stem and progenitor cells mediated by hypoxia inducible factor-1α in ischemic stroke model(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):319-322.

对于缺血性脑卒中，静脉溶栓、血管内介入治疗因受到时间窗限制，即使是发达国家，溶栓率也仅有10%左右。建立侧支循环、改善脑组织供血等治疗目前尚无大规模的随机对照试验证实其有效性。目前大量研究集中于缺血性脑卒中的长期神经功能修复，其中神经干-祖细胞(neural stem and progenitor cells,NSPCs)的神经再生功能靶向性促进神经功能恢复受到越来越多的关注。

NSPCs存在于哺乳动物大脑中，在急性脑梗死期以及慢性期，NSPCs这类细胞的再生功能对于靶向性促进脑的功能预后有一定意义[1]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)是一种缺氧应答因子。脑缺血缺氧时，HIF-1α表达上调，对脑缺血后能量代谢障碍的改善以及微循环的建立具有重要意义。本文综述HIF-1α在缺血性脑卒中模型中介导NSPCs机制的研究进展。

1 HIF-1α的结构与调节机制

1.1分子结构

HIF-1于1992年首次被发现[2]，由相对分子量为12,000的α亚基和3种分子量的β亚基组成异源二聚体，为碱性螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族成员。HIF-1α的编码基因位于染色体14q21-24，因其含有PER-ARNT-SIM (PAS)结构域，为其形成异源二聚体提供了必要条件[3]。

α亚基为HIF-1活性单位亚基，有一个独特的氧依赖降解区，对氧敏感，受组织氧浓度调节，是主要的调节因子；β亚基是结构性亚基，在细胞内稳定表达，一般不受缺氧状态的影响[4]，目前已经发现3种HIF-α异构体，HIF-2α也称为endothelial PAS(EPAS)，与HIF-1α有48%相似的氨基酸结构，在内皮、肺及软骨中持续表达；HIF-3α也称为IPAS，被认为是HIF-1α和HIF-2α的负调控因子[5-6]。

HIF-1α由826个氨基酸组成，2个末端是感受缺氧信号的活性调控区域，分别为C末端的氧依赖降解解构域(oxygen-dependent degradation domain,ODD)和C末端的反式激活结构域(C-transactivation domain,TAD-C)，以及N末端的反式激活结构域(N-transactivation domain,TAD-N)[7]。

1.2非氧依赖性调节机制

热休克蛋白90(heat shock proteins 90,Hsp90)可通过连接HIF-1α的PAS结构域调节HIF-1α的表达。当Hsp90被抑制时，蛋白激酶C受体1(receptor for activated C-kinase,RACK1)占据Hsp90的位点并促使HIF-1α降解[8]。在低氧环境下，脯氨酸羟化酶功能抑制，HIF-1α与Hsp90结合，转移至细胞核，被磷酸化，并与β亚基结合形成异源二聚体HIF-1，在细胞核p300、环磷酸腺苷反应原件结合蛋白等相关转录辅助激活因子的协同下，与低氧反应原件结合，形成转录起始复合物，诱导多种目的基因表达。此外，还有磷脂酰肌醇-3肌酶/丝氨酸-苏氨酸-苏氨酸蛋白激酶通路、丝裂原活化蛋白肌酶通路、原癌基因、微小RNA等调节通路。

1.3氧依赖性调节机制

HIF-1α的氧依赖性调节机制属于正性调节。在正常氧环境中，其C末端ODD上的脯氨酸402、564位点被脯氨酸羟化酶羟化，羟基化的HIF-1α通过与von Hippel-Lindau蛋白结合，再与泛素蛋白结合形成复合体，HIF-1α被泛素化，并经泛素连接酶复合通路降解。低氧环境下，羟基化被抑制，使HIF-1α降解受阻，从而激活下游靶基因的表达[10]。

1.4对下游基因表达的调控

HIF-1α是体内氧环境稳定的一个关键因子。在缺氧情况下，HIF-1α被激活，参与血管生成、葡萄糖转换和代谢、细胞凋亡以及细胞内压调节，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮素1、促红细胞生成素、诱导型一氧化氮合酶等超过100个下游基因的表达[9]。这些基因编码的蛋白参与血管新生与重塑、神经再生、葡萄糖转运及酵解、红细胞生成、氧化应激和炎症等多种病理生理过程。

2 NSPCs的生物学特点

2.1生理状态

NSPCs是一种哺乳类动物特有的多能细胞，广泛存在于中枢系统中胚胎时期的脑室下区(subventricular zone,SVZ)、海马齿状回颗粒区(subgranular zone,SGZ)[11-13]。NSPCs具有自我更新的功能，并可通过细胞不对称分裂方式产生神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞[11,14]。

依据成人海马区神经形成的不同发展程度，可将NSPCs分为3类：第1类为放射状胶质细胞样静止干细胞，它们表达胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白，并具有其他星形胶质细胞的特点；第2类为增殖性强，不表达胶质纤维酸性蛋白，表达巢蛋白的的细胞；第3类可分化出神经元。第1类也被称为神经干细胞，第2、3类被称为神经祖细胞[15]。

2.2缺氧状态

在脑缺血、脊髓损伤、神经系统退行性变等疾病状态下，NSPCs活化、增殖，可诱导成年神经细胞逆向分化为NSPCs[16]。在啮齿动物中，大脑中动脉闭塞时，SVZ的NSPCs可引起少突胶质细胞和星形胶质细胞增生，促进成神经细胞向大脑中动脉闭塞区迁移；然而能够成熟且存活的神经细胞数量很少。当大脑发生缺血或其他应激事件时，这种增殖调控会被触发，但持续的建立其取代受损神经细胞或重塑神经细胞的机制尚未被发现。

除了神经修复，NSPCs对新生血管的建立、延缓细胞死亡也有相应作用[17-19]。研究表明，啮齿类动物及人类脑缺血会刺激SVZ的NSPCs分化、增殖及变异，促使子代细胞进入缺血区域发挥一定作用[20-23]。NSPCs对治疗及改善脑梗死的预后有着特殊意义。

3 HIF-1α在缺血性脑卒中模型中对NSPCs的调节

3.1Notch通路

Notch通路最初的作用是决定中枢神经系统胚胎发生过程中神经干细胞的分化方向。神经系统成熟后，Notch通路阻断NSPCs最终分化，并维持干细胞的数量，防止其分化为成熟细胞[24]。小鼠Notch通路基因敲除后，祖细胞分化为神经细胞的趋势增加；反之，激活Notch通路会使得细胞更易保持在祖细胞状态下[25]。电刺激后，Notch通路可以促进脑缺血再灌注大鼠海马区NSPCs的增殖。

HIF-1α能够维持Notch信号通路的稳定，还与Notch信号通路的激活有关。

在缺氧状态下，胚胎型NSPCs及胚胎型癌P19细胞中，HIF-1α通过与活化的Notch-1连接，加强其稳定性，并增强其靶细胞的表达。低氧与Notch通路的协调作用维持神经干细胞的增殖，该过程需要HIF-1α与Notch信号通路间的相互作用。

Notch信号通路在成年动物脑内同样具有重要功能，特别与脑缺血损伤后神经修复关系密切。当组织缺氧缺血时，内皮细胞Delta样配体4表达上调，激活邻近细胞Notch受体，启动细胞内信号转导，促进血管发生和形成，对抗缺氧缺血性损伤。

但Cheng等[26]研究表明，在缺血性脑卒中患者中，HIF-1α调节的Notch通路可以加快神经元凋亡。在培养基中制造缺氧环境，通过对HIF-1α及Notch进行抑制，可发现神经元凋亡数显著减少。但HIF-1α调节Notch通路加快神经元凋亡的机制目前并不清楚。

3.2Wnt/β-catenin通路

Wnt信号通路作为一个复杂的蛋白质作用网络，通过自分泌和旁分泌调节多种细胞的发生和发育，具有重要的生物学意义。SVZ也有Wnt/β-catenin信号通路表达，在缺血性脑卒中状态下，该通路相应的蛋白表达上调[27-29]。

该通路通过激活原神经基因转录因子NeuroD1，刺激NSPCs向神经元转化[28,30-31]。激活Wnt信号可引发去磷酸化以及β-catenin的稳定和核转运。稳定的β-catenin与T细胞因子/淋巴增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)相连接，作用于NeuroD1启动子，进而影响NSPCs。HIF-1α调节Wnt/β-catenin信号，通过增强β-catenin-TCF/LEF的激活和表达，调节NSPCs的转化。在缺氧状态下，除神经系统外的组织细胞中，Wnt/β-catenin的表达下调。

结合近年来针对神经和血管的整体保护，提出神经血管单元(neurovascular unit,NVU)的新模型，发现Wnt信号通路在缺血性脑卒中NVU保护中可能发挥重要作用。

3.3HIF-1α在生理状态下对NSPCs的调节

HIF-1α在中枢系统NSPCs中持续且稳定地表达。哌莫硝唑是一种对于氧分压低于10 mmHg敏感的染色剂，研究表明，大鼠齿状回及颗粒下层区域所代表的缺氧区域可被哌莫硝唑染色[32]。海马颗粒下层HIF-1α、VEGF、碳酸酐酶Ⅸ等转录因子的稳定表达与哌莫硝唑染色相关。

NSPCs处在相对缺氧的脑组织区域，而HIF-1α的表达相对稳定。实验证明，SVZ及颗粒下层在相对缺氧环境下可不出现缺氧性损伤；但敲除HIF-1α基因的大鼠生理状态下NSPCs数量可减少近50%[33]。HIF-1α在维持NSPCs的稳定性方面可能起着重要作用。

3.4体外环境中HIF-1α对于NSPCs的调节

免疫电镜观察提示，培养基中NSPCs表达的HIF-1α在细胞膜结构中呈现游离型，可有效阻断NSPCs凋亡[34]。胚胎期及成年期啮齿类NSPCs在体外培养的无氧情况下，可持续表达HIF-1α，同时持续释放可溶性VEGF[35-36]。体外培养的NSPCs暴露于低氧低糖环境24 h后，HIF-1α和VEGF可增加至2倍。研究还发现，大脑内皮细胞和皮质神经元缺氧/缺血体外培养24 h，会出现细胞死亡现象；但在含有NSPCs的培养基中，内皮细胞和皮质神经元得到保护，未出现细胞死亡；应用VEGF-VEGFR2传导通路阻断剂后，内皮细胞和皮质神经功能受到抑制[35-36]。推测NSPCs在缺血缺氧条件下，可增加HIF-1α表达，上调VEGF水平，从而发挥促进血管内皮新生及神经功能修复作用。

4 NSPCs的基础研究进展

移植NSPCs被认为是一种治疗中枢神经系统疾病很有前途的方法。由于干细胞不稳定，植入体内可能诱发肿瘤发生，故只停留在实验阶段。Sugai等[37]发现，大鼠中枢神经系统植入NSPCs最终分化方向由体内微环境决定，通过病理分型可初步预测干细胞的分化结局。这对NSPCs移植在修复神经功能方面的安全性提供了一定的依据。Duncan等[38]研究证明，在脑梗死区及神经干功能区建立相应连接的“生物连接桥”，可为脑梗死后神经功能恢复提供益处。

5 NSPCs的临床研究进展

NSPCs在治疗脊髓疾病方面取得一定成果，提出在脊髓损伤修复中可应用内源性NSPCs细胞代替治疗。治疗策略有两类：①移植胚胎或成熟的NSPCs到脊髓病灶区；②重新激活和动员成熟脊髓内源性NSPCs。通过NSPCs分泌营养因子或形成少突胶质细胞，使残余轴突再髓鞘化，促进功能恢复[39]。Chapman等[40]通过对病程4.5 h内缺血性脑卒中患者的观察，发现并非在神经细胞死亡时才出现神经细胞再生，在缺血性脑卒中发生时，炎症反应即可促进NSPCs向神经细胞转化；通过调整神经系统局部微环境促进NSPCs的存活、分化，在早期神经功能修复中有一定意义。

6 展望

本文综述了HIF-1α在缺血缺氧条件下介导NSPCs存活、自我更新和分化的作用机制。通过上述机制靶向治疗调整NSPCs，能促进缺血性脑卒中后血管新生和神经功能修复，可能成为治疗缺血性脑卒中新的方向。但其有效性及安全性尚需研究证实。

目前已知，HIF-1α能介导NSPCs的更新分化；而在缺血缺氧状态下，NSPCs可分化为所需类型神经元，从而发挥作用；HIF-1α也是调控VEGF的重要上游因子，在缺血性脑卒中发生时，HIF-1α呈上调状态，对脑缺血后能量代谢障碍的改善以及微循环的建立有重要意义。目前已经形成了相对完整的理论，并在动物实验中获得良好效果。

未来有可能将HIF-1α诱导NSPCs的自我更新及分化，与HIF-1α调控VEGF促进血管生成两种机制相互补充，应用于缺血性脑卒中患者。更多后续研究应集中在寻找更多可有效促进NSPCs分化的方法，以及更加稳定的定向诱导的方式。此外，通过将NSPCs与“生物连接桥”连接植入受损组织，并加以诱导，产生所需的神经类型，发挥对应的神经功能，也是值得研究的方向。体外对NSPCs进行定向诱导，获取所需类型的神经细胞，并且将其安全植入受损组织，也会为缺血性脑卒中患者带来福音。

目前，内源性NSPCs已经初步应用于临床。外源性NSPCs的移植也是值得研究的领域。

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Mechanism of Neural Stem and Progenitor Cells Mediated by Hypoxia Inducible Factor-1α in Ischemic Stroke Model(review)

ZHANG Dong-yuan,LI Ming,WANG Zheng-ze,ZHANG Wen-ran,XU Xiao-dan,ZHANG Li-ying,TIAN Shen
Department of Neurology,the Forth Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110032, China

TIAN Shen.E-mail:cmu4h_ts1969@126.com

Hypoxia inducible factor-1α is a kind of hypoxia response factor.Acute cerebral ischemia and anoxia can induce up-regulation of hypoxia inducible factor-1α,and the downstream genes,which plays a role in both the energy metabolism and collateral circulation after cerebral ischemia.Neural stem and progenitor cells regeneration also benefit the functional outcome after ischemic stroke.Hypoxia inducible factor-1α may induce proliferation and differentiation of neural stem and progenitor cells through Notch,Wnt/β-catenin pathways, etc.,in the ischemic stroke model.

ischemic stroke;hypoxia inducible factor-1α;neural stem and progenitor cells;review

R743.3

A

1006-9771(2017)03-0319-04

2016-11-15

2017-01-04)

中国医科大学附属第四医院神经内科，辽宁沈阳市110032。作者简介：张东圆(1991-)，女，汉族，河北滦县人，硕士研究生，主要研究方向：缺血性脑卒中的治疗。通讯作者：田沈(1969-)，女，汉族，硕士，主任医师，主要研究方向：缺血性脑血管病。E-mail: cmu4h_ts1969@126.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.015