神龙抗栓胶囊微生物限度检查法的验证

王丽丽 杨丽霞

（1 大连蛇岛医院，辽宁 大连 116041；2 大连市旅顺口区中医医院，辽宁 大连 116041）

神龙抗栓胶囊微生物限度检查法的验证

王丽丽1杨丽霞2

（1 大连蛇岛医院，辽宁 大连 116041；2 大连市旅顺口区中医医院，辽宁 大连 116041）

目的建立神龙抗栓胶囊微生物限度检查法。方法按中国药典2015版采用增加稀释液的方法进行方法学验证。结果采用增加稀释液的方法，需氧菌检查中所要求的各实验菌样品中的回收率均达到50%以上。结论神龙抗栓胶囊所采用的检验方法可以消除制剂的抑菌作用，有效检出污染的微生物。

神龙抗栓胶囊；微生物限度检查法；回收率

神龙抗栓胶囊是大连蛇岛医院医院的特色制剂，其主要由水蛭、牛黄、红花、川芎、当归及蛇毒提取物组成，有活血化瘀，疏通经络的功效。主要用缺血性中风恢复期、后遗症期，属于淤血阻络者。神龙抗栓胶囊含有抑菌的药物成分，在微生物限度检测前需对其抑菌作用进行抑制或消除，检查结果才能代表制剂中实际污染的微生物数量[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器：超净工作台（生产商为苏州净化设备有限公司），手提式压力蒸汽灭菌器（生产商为上海三申医疗器械有限公司），电热恒温培养箱（生产商为上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 菌种：检测所用到的菌种分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。

1.3 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，胰酪大豆胨液体培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基，肠道菌增菌液体培养基，紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，麦康凯液体培养基，麦康凯琼脂培养基，RV沙门菌增菌液体培养基，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基，三铁糖琼脂培养基均由北京三药提供。

1.4 样品：神龙抗栓胶囊（批号：20160411，20160413，20160418）。

2 方法与结果

2.1 试验菌液制备：将新培养出来的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠埃希菌，用浓度为0.9%的氯化钠溶液调制为浓度合适的菌悬液；将新培养出来的黑曲霉混入浓度为0.9%的氯化钠溶液5 mL当中，用无菌试管将筛选好的孢子装好，再用浓度为0.9%的氯化钠溶液调制为浓度合适的黑曲霉孢子悬液。

2.2 调制供试液：量取10克的供试品，加胰酪大豆胨液体培养基至100 mL，混匀，制成1∶10的供试液。

2.3 计算回收率

2.3.1 常规方法预试验测定：①试验组：选取已调制好的供试液，注入待用试验菌液当中，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu，混匀，取1 mL注入平皿中。加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养平皿，放入胰酪大豆胨琼脂作为培养基，保持生长温度为30～35 ℃，培养时间为3 d，统计数量。将白色念珠菌、黑曲霉的培养平皿放入胰酪大豆胨琼脂作为培养基，30～35 ℃培养5 d；倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，20～25 ℃培养5 d，计数。每个试验组制备2个平皿。②菌液组：统计每个菌株试验菌的变化数量。③供试品对照组：选取已调制好的1 mL供试液，根据菌落计数方法检测供试品的基本菌数。表明：神龙抗栓胶囊无法抑制白色念珠菌和黑曲霉的生长，对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌的抑制作用较强。应选择合适的方法消除其在检验条件下对这两种菌的抑制作用，提高微生物的检出率。2.3.2 增加需氧菌稀释液的方法测定：①试验组：取上述供试液，稀释至1∶100，加入已制备好的试验菌液，使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu，混匀，取1 mL注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿30～35 ℃培养3 d，加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿，30～35 ℃培养5 d；②菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数。③供试品对照组：取上述供试液1 mL，按菌落计数方法测定供试品本底菌数[2]。得知，增加需氧菌稀释液可以让试验组的回收率在50%以上，表示使用增加需氧菌稀释液的方法能够抵制供试品的抑菌效果。因此需氧菌数的测定可以采用增加稀释液的方法。

2.4 控制菌检查方法的验证：①试验组：取上述1∶10供试液，及已制备好的试验菌液，接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，使每1 mL试验液中含菌量不大于100 cfu，依相应控制菌检查法进行。②阴性对照组：以稀释剂代替供试液照相应大肠菌群检查法进行。③阳性对照组：以试验菌液代替供试液照相应控制菌检查法进行，对照菌的加量应不大于100 cfu。使用控制菌的常规验证方法表示阳性对照的控制菌生长情况好，阴性对照的控制菌没有生长。说明了控制菌检查法具有专一性，因此，神龙抗栓胶囊的控制菌检查可以采用常规法。

3 讨 论

药品的微生物限度检查，应根据药品的性质选用适宜的一种或几种方法进行验证[3]，神龙抗栓胶囊的成分中，有一定的抑菌作用，因此在检查前，要首先消除药物的抑菌性。在之前的检查中，经过验证，神龙抗栓胶囊的微生物计数法检查采用培养基稀释法[4]（即取1 mL供试液分别加到5个培养皿中，计5个培养皿的菌落数总和）；考虑到微生物生长的特殊性，在2015版药典中，将微生物计数法试验中的回收率调整为50%，以及药品是中药原粉，取样存在不均匀性；因此，采用了增加稀释液的方法。结果表明采用增加稀释液的方法，可以使试验菌在需氧菌的检查验证试验中的回收率达到50%以上，方法可行。

[1] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国科学技术出版社,2005:325-358.

[2] 中国药典.2015年版[S].四部.中国医药科技出版社,2015:142-143.

[3] 张敏.保妇康栓微生物限度检查法的验证[J].海南医学院学报,2009,15(1):22-23.

[4] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000:60.

R282.710.3 文献标识码：B 文章编号：1671-8194（2017）30-0024-02