神龙抗栓胶囊微生物限度检查法的验证

2017-01-15 15:23王丽丽杨丽霞
中国医药指南 2017年30期
关键词:抗栓试液神龙

王丽丽 杨丽霞

(1 大连蛇岛医院,辽宁 大连 116041;2 大连市旅顺口区中医医院,辽宁 大连 116041)

神龙抗栓胶囊微生物限度检查法的验证

王丽丽1杨丽霞2

(1 大连蛇岛医院,辽宁 大连 116041;2 大连市旅顺口区中医医院,辽宁 大连 116041)

目的建立神龙抗栓胶囊微生物限度检查法。方法按中国药典2015版采用增加稀释液的方法进行方法学验证。结果采用增加稀释液的方法,需氧菌检查中所要求的各实验菌样品中的回收率均达到50%以上。结论神龙抗栓胶囊所采用的检验方法可以消除制剂的抑菌作用,有效检出污染的微生物。

神龙抗栓胶囊;微生物限度检查法;回收率

神龙抗栓胶囊是大连蛇岛医院医院的特色制剂,其主要由水蛭、牛黄、红花、川芎、当归及蛇毒提取物组成,有活血化瘀,疏通经络的功效。主要用缺血性中风恢复期、后遗症期,属于淤血阻络者。神龙抗栓胶囊含有抑菌的药物成分,在微生物限度检测前需对其抑菌作用进行抑制或消除,检查结果才能代表制剂中实际污染的微生物数量[1]。

1 仪器与材料

1.1 仪器:超净工作台(生产商为苏州净化设备有限公司),手提式压力蒸汽灭菌器(生产商为上海三申医疗器械有限公司),电热恒温培养箱(生产商为上海跃进医用光学器械厂)。

1.2 菌种:检测所用到的菌种分别为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。

1.3 培养基:胰酪大豆胨琼脂培养基,胰酪大豆胨液体培养基,沙氏葡萄糖琼脂培养基,肠道菌增菌液体培养基,紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基,麦康凯液体培养基,麦康凯琼脂培养基,RV沙门菌增菌液体培养基,木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基,三铁糖琼脂培养基均由北京三药提供。

1.4 样品:神龙抗栓胶囊(批号:20160411,20160413,20160418)。

2 方法与结果

2.1 试验菌液制备:将新培养出来的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠埃希菌,用浓度为0.9%的氯化钠溶液调制为浓度合适的菌悬液;将新培养出来的黑曲霉混入浓度为0.9%的氯化钠溶液5 mL当中,用无菌试管将筛选好的孢子装好,再用浓度为0.9%的氯化钠溶液调制为浓度合适的黑曲霉孢子悬液。

2.2 调制供试液:量取10克的供试品,加胰酪大豆胨液体培养基至100 mL,混匀,制成1∶10的供试液。

2.3 计算回收率

2.3.1 常规方法预试验测定:①试验组:选取已调制好的供试液,注入待用试验菌液当中,使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu,混匀,取1 mL注入平皿中。加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养平皿,放入胰酪大豆胨琼脂作为培养基,保持生长温度为30~35 ℃,培养时间为3 d,统计数量。将白色念珠菌、黑曲霉的培养平皿放入胰酪大豆胨琼脂作为培养基,30~35 ℃培养5 d;倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基,20~25 ℃培养5 d,计数。每个试验组制备2个平皿。②菌液组:统计每个菌株试验菌的变化数量。③供试品对照组:选取已调制好的1 mL供试液,根据菌落计数方法检测供试品的基本菌数。表明:神龙抗栓胶囊无法抑制白色念珠菌和黑曲霉的生长,对铜绿假单胞菌及枯草芽孢杆菌的抑制作用较强。应选择合适的方法消除其在检验条件下对这两种菌的抑制作用,提高微生物的检出率。2.3.2 增加需氧菌稀释液的方法测定:①试验组:取上述供试液,稀释至1∶100,加入已制备好的试验菌液,使每1 mL供试液中含菌量不大于100 cfu,混匀,取1 mL注入平皿中,倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的试验平皿30~35 ℃培养3 d,加入白色念珠菌、黑曲霉的试验平皿,30~35 ℃培养5 d;②菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数。③供试品对照组:取上述供试液1 mL,按菌落计数方法测定供试品本底菌数[2]。得知,增加需氧菌稀释液可以让试验组的回收率在50%以上,表示使用增加需氧菌稀释液的方法能够抵制供试品的抑菌效果。因此需氧菌数的测定可以采用增加稀释液的方法。

2.4 控制菌检查方法的验证:①试验组:取上述1∶10供试液,及已制备好的试验菌液,接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中,使每1 mL试验液中含菌量不大于100 cfu,依相应控制菌检查法进行。②阴性对照组:以稀释剂代替供试液照相应大肠菌群检查法进行。③阳性对照组:以试验菌液代替供试液照相应控制菌检查法进行,对照菌的加量应不大于100 cfu。使用控制菌的常规验证方法表示阳性对照的控制菌生长情况好,阴性对照的控制菌没有生长。说明了控制菌检查法具有专一性,因此,神龙抗栓胶囊的控制菌检查可以采用常规法。

3 讨 论

药品的微生物限度检查,应根据药品的性质选用适宜的一种或几种方法进行验证[3],神龙抗栓胶囊的成分中,有一定的抑菌作用,因此在检查前,要首先消除药物的抑菌性。在之前的检查中,经过验证,神龙抗栓胶囊的微生物计数法检查采用培养基稀释法[4](即取1 mL供试液分别加到5个培养皿中,计5个培养皿的菌落数总和);考虑到微生物生长的特殊性,在2015版药典中,将微生物计数法试验中的回收率调整为50%,以及药品是中药原粉,取样存在不均匀性;因此,采用了增加稀释液的方法。结果表明采用增加稀释液的方法,可以使试验菌在需氧菌的检查验证试验中的回收率达到50%以上,方法可行。

[1] 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国科学技术出版社,2005:325-358.

[2] 中国药典.2015年版[S].四部.中国医药科技出版社,2015:142-143.

[3] 张敏.保妇康栓微生物限度检查法的验证[J].海南医学院学报,2009,15(1):22-23.

[4] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000:60.

R282.710.3 文献标识码:B 文章编号:1671-8194(2017)30-0024-02

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