浅析影响口蹄疫O型液相阻断ELISA实验的因素

李世凤,吴得瑞

(甘肃省民乐县动物疫病预防控制中心，734500)

浅析影响口蹄疫O型液相阻断ELISA实验的因素

李世凤,吴得瑞

(甘肃省民乐县动物疫病预防控制中心，734500)

液相阻断ELISA，是检测口蹄疫病毒抗体的国际标准，敏感性高，特异性强，判定结果客观，主要用于检测抗体，评价FMD疫苗的免疫效力，也就是疫苗免疫动物的抗强毒攻击能力。目前，民乐县动物疫病预防控制中心广泛采用ELISA法检测口蹄疫免疫抗体，评价免疫效果，为全县动物疫情预警提供有效依据。

1 ELISA实验基本原理

ELISA是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

2 实验过程

2.1 器材准备：口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒；酶联免疫检测仪(伯腾ELX800)；洗板机(伯腾ELX50)；水质要求：无离子水或者蒸馏水均可。

2.2 操作步骤

2.2.1 抗原抗体反应稀释血清；加病毒抗原：封板，震荡，37℃温育90分钟；移板，封板，37℃温育60分钟；洗板，加豚鼠抗体工作液，37℃温育30分钟；洗板，加兔抗豚鼠IgG-HRp工作液，37℃温育30分钟；洗板，加底物溶液，37℃温育15分钟，再加终止液终止反应，读取D490nm。

2.3 结果判定

2.3.1 试验成立标准：病毒抗原对照D490nm值应该在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1∶1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1∶8。

2.3.2 抗体效价的判定：被检血清D490nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于临界值的孔为阳性孔。

2.3.3 结果判定：抗体效价大于或者等于1∶128判为抗体阳性；1∶64～1∶128时，判为可疑；小于1∶64，判为阴性。可疑血清样品，重测抗体效价大于或者等于1∶128，判为阳性，小于1∶128，判为阴性。

3 影响实验结果的因素及改进措施

3.1 贮藏。试剂盒应严格按照说明书存放。（病毒抗原-20℃存放，其他成分2℃-8℃存放。）

3.2 回温。试剂盒在使用前应于室温下充分回温（时间30分钟为宜）。回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用。不同厂家的试剂盒不能混用，同一厂家不同批次的试剂盒也不能混用。被检血清需缓慢升至室温，冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清样品应先离心或者过滤，澄清后再检测。

3.3 相关试剂的配制

PBST洗涤液现用现配，尽量用新鲜的不要多配制，底物溶液应主要避光保存，临用5分钟内加入双氧水。熟悉移液器的使用，加样时应加在孔底部，避免加在孔壁上部，并且注意不可溅出。加样时不可触及酶标板底部，以免吸附板底的反应结合物脱落。加样后及时放入恒温箱，样本较多时，要分批操作。每次加样最好在2-3分钟内完成。每次加样完进行计时。

3.4 样品稀释。样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。

3.5 温育时一定要贴封膜，否则容易造成标本或者稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于彻底清洗。反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。

3.6 样品温育时间结束后，马上甩去孔内液体。如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸（选择无或者少尘的吸水材料）上，再依次进行洗涤。使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次。采用自动洗板机洗板时，洗液要加足（300微升），保证洗板针畅通。

3.7 提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数。误差是由很多细节造成的，减少误差的方法有很多，比如做实验时少说话，防止唾液掉进酶标条中；加样时，由低浓度向高浓度加，这样减少跳孔的几率；勤换枪头。总之优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是做好ELISA实验的必要条件。在实际操作中必须严格按照规定操作，以严谨的态度检测每一份待检样品，才能保证实验结果的准确。

S853.7

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1003-8655（2017）01-0072-01