反刍动物分枝杆菌病及其进出境检疫技术应用探讨

陈 茹

（广东出入境检验检疫局技术中心，广东广州 510623）

反刍动物分枝杆菌病及其进出境检疫技术应用探讨

陈 茹

（广东出入境检验检疫局技术中心，广东广州 510623）

反刍动物结核病、副结核病等分枝杆菌病对全球畜牧业危害严重，是国际贸易中重点防范的动物疫病。本文从病原学、检测方法及其应用方面，对反刍动物结核病、副结核病进行了综述，并结合我国进出境动物检验检疫工作实际，就上述疫病口岸检疫技术的运用进行了探讨。同时，针对动物种类及相应检测方法与试剂选用等具体情况，提出了建议。

反刍动物；牛结核；副结核；分枝杆菌；进出境检验检疫

反刍动物结核病、副结核病等分枝杆菌病给全球畜牧业带来了严重经济损失，对人类健康亦构成了重大威胁。牛结核病、副结核病早已被列入世界动物卫生组织（OIE）疫病名录，是国际贸易中重点关注的动物疫病。我国对进出境牛、羊等反刍动物，实施严格的结核病、副结核病检疫措施。

1 反刍动物结核病

1.1 病原

分枝杆菌广泛存在于自然环境中，迄今已发现上百种，其中对人畜具有致病性的超过50种[1-2]。分枝杆菌（Mycobacterium）属放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属，属内划分为结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）、麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）和非结核分枝杆菌（Non-tuberculosis mycobacterium，NTM）3大类。MTC可引起人与哺乳动物的结核病，主要包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、卡介苗BCG（Mycobacterium bovisBCG）、非洲分枝杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti）等菌种。随着新菌种的发现与研究的深入，羊分枝杆菌（M.caprae）、鳍分枝杆菌（M.pinnipedil）以及在非洲患者中分离到的M.canettii分枝杆菌也被归类为MTC成员。有观点认为羊分枝杆菌也应被列为牛分枝杆菌的亚种[3]。

反刍动物结核病的病原是MTC的成员，主要致病菌种是牛分枝杆菌。此外，已发现在一些国家发生的羊结核病病原主要为羊分枝杆菌[4]，还有一些动物结核病由结核分枝杆菌引起[5-6]。牛分枝杆菌、结核分枝杆菌能够在人和多种动物中相互传播并引起相关疾病，严重影响公共卫生安全及人类健康。牛分枝杆菌是MTC中宿主范围最为广泛的菌种，可感染人和牛等50多种哺乳动物和20多种禽类[7-8]。在一些发展中国家，由牛分枝杆菌感染引起的人肺结核约占10%[8]。国外早期已发现结核分枝杆菌可感染牛、猫、犬、猴等与人类接触密切的动物，并从动物结核病例中已分离到结核分枝杆菌[5-6]。

1.2 检测技术

动物结核病检测技术包括结核菌素皮内变态反应、γ -干扰素体外释放检测、病原菌核酸分子生物学检测、常规ELISA以及病原菌分离培养等。

1.2.1 结核菌素皮内变态反应。结核菌素皮内变态反应（简称皮试）是动物结核病的传统检测方法，应用广泛，被OIE列为检测牛结核的指定方法，可采用牛型结核菌素（PPD）颈部皮试、牛型PPD尾根部皮试以及采用牛型和禽型PPD颈部比较皮试3种具体操作方法。颈部比较皮试法：在颈部不同部位（同侧需相隔12~15 cm）分别注射牛型PPD和禽型PPD，72 h后，根据牛型PPD注射部位的皮厚增加减去禽型注射部位的皮厚增加进行结果判定。禽型PPD皮试结果代表NTM感染情况，采用2种PPD同时进行皮试，可通过比较排除NTM感染造成的非特异性反应，准确性较高。尾根部皮试的敏感性低于颈部皮试，采用前者时可适当增加注射剂量。迄今对于大多数非牛科动物和非鹿科动物种类，尚未能进行皮试检测适用性验证评估[9]。结核菌素的注射剂量和制剂质量对于检测结果有关键影响。OIE规定牛型PPD的皮内注射剂量不得低于2 000 IU，当用于牛结核根除计划时，推荐用5 000 IU。市场上一些结核菌素制剂在规定体积内达不到2 000 IU[10]。结核菌素是通过对分枝杆菌在液体培养基中增殖后的产物，进行蛋白粗提和纯化后获得的诊断制剂，其纯度不高，可能含有其他致敏因子，也会导致动物产生过敏反应，出现假阳性[11]。

1.2.2 γ -干扰素体外释放检测。γ -干扰素体外释放检测的原理是基于血液T淋巴细胞对结核菌素的细胞免疫反应。需采集肝素抗凝外周血，用牛型PPD和禽型PPD平行刺激血样，过夜培养后，感染牛分枝杆菌的细胞在PPD的刺激下将分泌产生γ -干扰素（IFN-γ），通过IFN-γ 单克隆抗体夹心ELISA进行检测。该法也简称IFN-γ ELISA。目前代表性的诊断试剂是BOVIGAM牛γ -干扰素检测试剂盒（OIE批准注册号20150110）。OIE声明该产品适用于检测牛、水牛、山羊和绵羊中牛分枝杆菌以及MTC其他菌种的感染，适用于以下目的：无疫病史确认；发生疫情后重新确认无疫病状态；为动物及其产品的贸易和移动提供个体无感染或无病原因子证明；对特定动物群体实施根除感染；对疑似病例或临床病例进行确证诊断（包括对初筛阳性结果进行确证）；为风险分析提供感染流行状况评估；为结核病根除计划提供辅助检测[12]。国内学者研究表明，与皮试法相比较，用IFN-γ ELISA检测奶牛结核病可提高特异性[13]，对于皮试阳性和可疑牛，可用IFN-γ ELISA复检以排除部分假阳性[14]。

1.2.3 常规ELISA检测。常规ELISA方法在结核病检测中目前仅用于检测抗体，但不及皮试法和IFN-γ ELISA应用普遍，主要影响因素是诊断抗原和检测灵敏度问题。分枝杆菌感染后早期诱导细胞免疫反应，在晚期才诱导体液免疫反应，所以皮试和IFN-γ ELISA法对早期感染检测效果好。此外，MTC的菌种生长缓慢，在感染过程的不同阶段分泌不同的蛋白质，依赖单一抗原蛋白的抗体检测法灵敏度低，采用多抗原联合检测（鸡尾酒法）或多抗原融合蛋白检测可显著提高灵敏度[8]。现代ELISA抗体检测技术采用在牛分枝杆菌特有的2种血清优势抗原蛋白（MPB70和MPB83）基础上增加更多的抗原，检测灵敏度有了较明显改进。

1.2.4 核酸分子生物学检测方法。1998年结核分枝杆菌全基因组测序以及2003年牛分枝杆菌全基因组测序的完成，为建立结核病原菌核酸检测方法提供了分子基础。目前已报道的有常规PCR、PCR-核酸探针杂交、实时荧光PCR、固相基因芯片法、液相基因芯片法、变性高效液相色谱法等，检测的靶基因有MTC特有的插入序列IS6110、IS1081，以及结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的结构蛋白基因。应用较多的是PCR和实时荧光PCR法。美国已发布结核病原菌PCR检测指南标准（ASTME 2048—1999），我国已发布实时荧光PCR检测方法国家标准（GB/T 27639—2011）。目前，国内外均开展了对皮试阳性牛进行结核病原菌PCR检测研究。Barry等[15]从10头份皮试阳性牛的血样中检出9份PCR阳性；蔡宏等[16]从28头份皮试阳性牛血样中检出23份PCR阳性，从12头份奶样中检出7份PCR阳性。

1.3 进出境检疫技术探讨

进出境动物检疫时间紧、要求高，需采用适合活体采样检测的技术。随着国内市场对进口动物需求的多样化，进口品种中除常规种用或食用的牛羊种类外，还不断出现鹿、羊驼、长颈鹿等用于观赏及其他用途的动物种类，给进出境检疫工作带来新的挑战。

对于反刍动物结核病检测，皮试法是经典方法，也是目前应用最为广泛的法定检测方法。但其准确性易受试剂质量、具体操作以及NTM感染等多种因素影响。培养法耗时长，并且受到生物安全管理规定的约束，一般不采用。IFN-γ ELISA法试剂成本较高，采集的血样需在30 h内进行检测，目前尚未验证该法是否适用于牛羊之外不常见的反刍动物种类。常规ELISA方法尚缺乏成熟的市场化试剂。核酸检测方法需对样品进行病原菌核酸提取，检测过程需注意防核酸污染造成的假阳性。在进出境检疫工作实际中，应在法定检测方法基础上，根据具体情况联合运用多种检测技术，以确保检得出、检得准。

建议如下：（1）对于能够实施皮试的动物，采用皮试进行初筛（首选颈部比较皮试法），对皮试阳性的动物，采用IFN-γ ELISA法进行复核检测，可再辅助采用经验证可靠的PCR等核酸检测方法进一步复核；对于不能开展IFN-γ ELISA法检测的，直接采用核酸检测方法进行复核检测。（2）对于不适合实施皮试的动物，可采血样，直接用IFN-γ ELISA法或核酸方法检测。IFN-γ ELISA法由于是基于夹心ELISA原理，其酶标抗体是抗IFN-γ 抗体，应适用于各种动物种类的检测，但OIE目前仅对牛、羊进行了方法和试剂验证，仅声明适用于牛、羊，没有提及其他动物种类。（3）对于不能确定适用诊断试剂类别的动物种类，直接采用PCR等核酸检测方法。

2 反刍动物副结核病

2.1 病原

副结核病（Paratuberculosis，Johne´s disease）临床上以动物持续性腹泻、慢性消瘦、肠炎等为特征，是一种以牛、羊等反刍动物为主的消耗性、慢性传染病，马、鹿等多种动物也可感染发病。副结核病的病原是副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. Paratubercilosis，MAP）。MAP在分类上归属鸟分枝杆菌的一个亚种，其主要感染动物消化道，也可感染乳腺和生殖器官，症状明显和隐性感染的病畜均能向体外排菌，主要随粪便排出，也可经乳汁、精液或胎盘垂直感染。目前副结核病呈全球性分布，难于根除，受其影响较大的仍然是家养或野生类反刍类动物。MAP与人的一种慢性肠道疾病克罗恩氏病的关联是当前医学研究的热点。虽然对于MAP是否是人类克罗恩氏病的致病因子尚有争议，但MAP对食品安全的影响已在欧美等发达国家引起广泛重视。

2.2 检测技术

副结核病检测技术包括以ELISA为代表的血清学检测技术，以PCR为代表的病原核酸分子生物学检测技术、皮试检测技术和病原菌分离培养技术等。OIE将目前已有的各类检测方法及其适用目的进行了概括[17]。OIE鼓励联合采用多种方法进行副结核病原或抗体检测。

2.2.1 ELISA方法。常规ELISA是目前全球最为广泛应用的副结核血清学检测技术，普遍采用吸附ELISA技术原理。其基本检测步骤：采用含草分枝杆菌（M. phlei）抗原的缓冲液对待检血清进行预处理，去除非特异抗体的干扰；将经预处理的待检血清加到包被了MAP特异抗原的检测板中，样品中MAP抗体与固相包被抗原结合形成抗原-抗体复合物，洗涤去除非结合物，加入过氧化物酶标记的抗反刍动物IgG（也有采用酶标记的抗牛IgG、酶标记的蛋白G、蛋白A等）；加入显色底物，通过测量吸光度值进行结果判定。由于环境中存在多种分枝杆菌，若感染动物易产生非特异性抗体，采用M. phlei抗原能够吸附待检样品中非特异分枝杆菌抗体，从而提高检测特异性。选用副结核抗体ELISA商品化试剂盒时，需评估其是否适用于不同反刍动物类别。目前一些品牌的试剂盒都声明适用于牛、羊或小反刍动物，但对于不常见的物种，如羊驼、鹿等野生动物，如果没有确切信息，则应对拟选用的试剂盒进行验证或改进。国外学者对商品化试剂盒进行改进，采用酶标记的抗羊驼IgG取代酶标抗牛IgG，使之适用于羊驼副结核抗体检测[18]，或采用酶标蛋白A、酶标抗骆驼IgG，来取代抗反刍动物IgG或抗牛IgG，使之适用于骆驼副结核抗体检测[19]。

2.2.2 皮试法。副结核皮试法通过在动物颈部注射禽型PPD或Johnin PPD，来检测感染后动物体内的细胞介导免疫反应。禽型PPD和Johnin PPD分别来自鸟分枝杆菌和MAP培养物的纯化蛋白提取物。皮试法由于操作简单、成本低的特点，在国内外仍被广泛应用。副结核皮试的常规判定依据是注射前后注射部位的皮厚肿胀差。但鹿的副结核皮试炎症反应通常呈现为弥散样斑块、而肿胀不明显，因此对于鹿的副结核皮试检测，凡注射部位呈现肿胀（无论是否达到通常适用于牛的肿胀差判定标准），应判为阳性反应[17]。

2.2.3 核酸分子生物学检测方法。副结核分枝杆菌（MAP）核酸分子生物学检测鉴定方法是基于核酸扩增和对扩增产物的进一步分析，包括核酸探针杂交、RFLP分析、序列分析等。目前主要应用的有PCR联合PCR产物分析和实时荧光PCR，其目标基因常见选用MAP基因组插入序列IS900和结构基因F57。IS900以高拷贝（15~20 copies）的形式存在于MAP基因组中，由于在其它分枝杆菌基因组中发现了与IS900高度同源的序列，对IS900 PCR检测阳性的结果应进行测序等进一步分析确证[20]。我国发布的MAP实时荧光PCR方法以F57为目标基因（GB/T 27637—2011）。欧美国家广泛采用了PCR等核酸检测方法对奶制品进行MAP污染监测[21-22]。可采集动物粪样、血样、奶样等，进行病原菌核酸检测。其中，粪样等基质复杂的样品的预处理和病原菌核酸提取效率，对PCR等核酸检测结果有较大影响。

2.3 进出境检疫技术探讨

受检疫周期所限，牛羊副结核进出境检疫一般采用ELISA、皮试法，一般不采用培养法，PCR等核酸检测方法目前主要用于对初筛检测结果的确证。琼扩、补体结合试验方法由于缺乏试剂、操作繁琐、准确性不理想等因素，已逐渐淘汰。根据现行双边检疫和卫生要求，我国对进境牛羊的副结核检疫主要采用禽型PPD皮试和ELISA方法。

在副结核进出境检疫技术的运用方面，需关注两个问题：（1）试剂的选用和验证。目前，国家层面尚缺乏对PPD试剂和副结核抗体ELISA检测试剂盒的评价和验证信息，难于判断因试剂质量差异对检疫结果造成的影响。对于羊驼、骆驼等不常见的物种、能否采用常规用于检测牛羊的ELISA试剂盒，尚缺乏必要的技术信息和用于验证试剂盒的标准物质。（2）对于皮试、ELISA检测阳性结果，尚无明确规定要进行确证检测以及如何进行确证。根据现行的双边检疫和卫生要求议定书，若采用规定的皮试或ELISA方法检出阳性，则可剔除阳性动物。但当初筛检测出现异常高比例阳性结果时，往往给进出境检疫工作带来被动。

建议如下：（1）组织试剂质量验证评估，收集并公布相关试剂品牌的质量评估和验证信息，提供选用指南；（2）对于不能确定适用血清学试剂的特殊动物种类，采用皮试联合PCR等核酸检测方法；对于不适宜实施皮试的动物，直接采用PCR等核酸检测方法，活体采集粪样或肠道拭子、全血样品进行检测；（3）如果能够获得试剂，可采用琼扩、补体结合试验等不受动物种属类别限制的血清学检测方法；（4）对于皮试、ELISA等抗体检测阳性结果，鼓励采用PCR等核酸检测方法进行病原菌确证检测，除对动物个体采样，还应采集隔离或饲养场所环境样本。

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（责任编辑：朱迪国）

A Review on Research of Mycobacterial Diseases of Ruminants and Application of Their Entry-exit Quarantine Techniques

Chen Ru
（Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623）

Mycobacterial diseases，such as Bovine tuberculosis and Paratuberculosis，have brought serious harm to global animal husbandry，which are important animal diseases in international trade. The aetiological studies and diagnosis technologies of the two diseases were reviewed in terms of etiology，detection methods and their applications in this paper. Combined with the practice of entry-exit animal inspection and quarantine in China，the applications of quarantine technology of the above epidemic diseases were discussed. Suggestions were put forward，in view of specif i c situations of different animal species and the selection of diagnostic methods and reagents.

ruminant；Bovine tuberculosis；Paratuberculosis；Mycobacterium；entry-exit quarantine

S852.61+8

A

：1005-944X（2017）07-0080-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.023