FMDV疫苗规模化生产过程中生物反应器参数控制对病毒增殖的影响

安芳兰，刘学荣，董文教，武发菊，葛玉凤，杨惠清，万玉林，杨进才，张云德，殷宏

（1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州730046；2.兰州兽医研究所，甘肃兰州730046）

FMDV疫苗规模化生产过程中生物反应器参数控制对病毒增殖的影响

安芳兰1，刘学荣1，董文教1，武发菊1，葛玉凤1，杨惠清1，万玉林1，杨进才1，张云德1，殷宏2※

（1.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州730046；2.兰州兽医研究所，甘肃兰州730046）

为探讨生物反应器参数控制对规模化培养过程中口蹄疫病毒增殖的影响，通过L9(34)正交试验筛选温度、DO值、pH值和搅拌转速等参数对病毒繁殖的影响，确定最适过程控制参数并进行放大应用效果研究，为规模化生产工艺的定型提供数据支持。结果表明：当温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6、DO值为50.0%～70.0%、搅拌转速50～70 r/min，可有效提高口蹄疫病毒增殖能力，放大应用效果良好。

FMDV；生物反应器；参数控制；增殖；影响

口蹄疫（FMD）在我国的流行由来已久，给畜牧业发展造成巨大损失[1]，而在该病的防治现在全世界仍以常规疫苗为主，我国也是如此。在今后相当长一段时间内灭活疫苗仍然会占主导地位，而国际上口蹄疫灭活疫苗的生产已采用先进的悬浮培养规模化生产技术[2]，近年来随着疫苗行业的不断发展，人们对疫苗品质和产量要求的不断提高，传统的疫苗生产方式已经跟不上社会的需求，因此疫苗规模化生产技术应运而生，我国口蹄疫灭活疫苗也正在逐步步入规模化生产模式。所谓病毒规模化培养技术（large-scale culture technology）是指利用计算机软件控制各种影响病毒质量的参数如pH值、温度、DO值和搅拌转速（Agit）等，在生物反应器（bioreactor）中大量培养病毒用于疫苗生产的技术。

中国幼仓鼠肾细胞（Baby Hamster Kidney Cell，BHK-21）,是目前生产口蹄疫疫苗的最主要的工程细胞[3]，BHK-21是目前用来生产口蹄疫病毒的唯一细胞，其病毒生产过程中除了要满足培养过程中必需的营养需求外，有必要建立合理的控制模型，因此进行pH值、DO值、温度、Agit和接毒条件的优化，使系统始终处于最佳状态，以满足FMDV的最佳生长条件和较高的病毒滴度，从而为规模化生产病毒的工艺确定提供数据支持。

1 材料

1.1 试验细胞

BHK-21细胞，批号为BHK-21/W/S，由ETCC提供。

1.2 培养基

培养基MD611，由清大天一生产；培养基MEM1611-030，委托宜兴赛尔公司加工。

1.3 新生犊牛血清

购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生犊牛血清内控质量标准检验合格后使用。

1.4 毒种

O/MYA98/BY/2010、O/PanAsia/TZ/2011、Re-A/ WH/09悬浮细胞毒，由中农威特生物科技股份有限公司生产。

1.5 主要设备

5L生物反应器，由美国NBS公司生产；500L生物反应器（中农威特现有生物反应器）；细胞分析仪，由德国INNIVATIS公司生产；生物安全柜等。

1.6 小鼠及乳鼠

从兰州兽医研究所实验动物中心引进繁殖的昆明种小鼠，体重18～22g，乳鼠系2～3日龄小鼠。

2 方法

2.1 试验设计

试验采用L9(34)正交实验设计，选取温度（T）、pH值、DO值和Agit作为考察因素，分别命名为A、B、C、D 4个因素，以146S含量为评价指标，确定病毒培养过程中参数控制对病毒增殖的影响，从而进行差异显著性分析，对3个最优组病毒液TCID50、LD50进行检测，试验重复3次。水平及正交实验方案见表1和表2。

2.2 病毒培养

将5L生物反应器中已培养好的对数生长期的细胞4℃～8℃静置，待细胞沉降后弃掉上清，加入病毒维持液，终体积为500 mL，按病毒维持液体积的5%加入种毒，其生物反应器主要控制参数设定见表1，其他条件相同，生物反应器均自动控制，测定146S含量，对3个最优组病毒液TCID50、LD50进行检测，试验重复3次。

2.3 培养工艺放大效果验证

采用前期在5L生物反应器所获得的生物反应器工艺，对3个毒种的病毒在500L生物反应器进行扩大培养，检测病毒液TCID50、LD50和146S含量，试验重复3次。

2.4 检测方法

2.4.1 146S含量检测按《口蹄疫灭活疫苗中间品及成品146S抗原含量检测方法》进行检测。

2.4.2 LD50和TCID50检测按常规方法进行。

3 结果

3.1 过程参数控制对病毒效价的影响

按照预先确定的细胞密度及病毒的接种量接种后，对过程参数控制进行优化，可实现生产工艺的最大优化策略，具体设计如表1所示。

表1 因子水平表

表2 L9(34)正交试验设计与结果分析

表2所示，8号试验组146S含量最高，由此可见当温度、Agit在3水平、pH值在2水平、DO在1水平时146S含量最高，可见该组合可有效提高146S含量，因此各因子的最佳水平组合为：A3B2C1D3，即温度37.0℃，pH值7.6、DO为50.0%、搅拌为70 r/min时，极差分析表明：RA＞RB＞RC＞RD，从而确定温度和pH值对病毒增殖的影响较大。

对较优的三组进行差异显著性分析，结果表明，第5组、第7组和第8组差异不显著，然后对此三组进行病毒效价的检测，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，结果如下图1。

图1 不同组别病毒滴度分析图

由图1可知，病毒效价TCID50和LD50均高于8.0，说明此三个组合均可用于病毒的大规模培养，因此病毒生产的参数宜控制如下：温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值50.0%～70.0%、搅拌转速50～70r/min。

3.2 不同毒型的病毒工艺放大验证

如表3所示，用该工艺生产O/MYA98/BY/2010株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量为107.50LD50～108.50LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量为107.50TCID50～108.17TCID50，每1.0mL病毒液146S含量为1.95～2.85μg；O/PanAsia/TZ/2011株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量为107.50LD50～108.00LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0mL病毒液146S含量为1.47～1.75μg；Re-A/WH/09株病毒，每0.2mL的病毒液病毒含量为107.00LD50～107.67LD50，每1.0mL的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0mL病毒液146S含量为1.96～2.22μg。可见，采用5L生物反应器病毒培养参数进行500L病毒的培养，实现了生产工艺的直线放大，为规模化口蹄疫疫苗生产提供了数据支持。

表3 不同毒种病毒含量及146S含量结果

4 结论

4.1 本研究采用L9（34）正交试验设计，有效的筛选5L生物反应器生物反应器病毒增殖的最佳控制范围：温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值50.0%～70.0%，搅拌转速50～70r/min，是一种多、快、好、省的设计方法，进一步加快了试验的进程，为病毒增殖条件的优化提供新的思路与方法。

4.2 利用5L生物反应器所获得的参数，进行三种病毒的500L规模的增殖验证，效价和146S均符合疫苗规程要求。

4.3 可见通过该实验获得的病毒增殖控制参数，实现生产工艺的从5L到500L规模的直线放大，为规模化口蹄疫疫苗生产提供了数据支持。但在口蹄疫疫苗规模化生产工艺中，还有诸多因素会对口蹄疫灭活疫苗生产产生较大的影响，应将继续开展相关试验，研究和探索口蹄疫疫苗生产关键技术的连锁效应，进一步提升我国规模化疫苗的生产技术。

[1]石慧,王仲兵,郑明学，等．国内外口蹄疫的流行情况及防制[J]．畜禽业,2009,（6）:48-51

[2]Telling R C.IndustralProduction of FMD Vaccine using Suspension Cell Some Comparative Results Relating“in vitro”Assay and Cattle Potency[R].Meeting of theResearch Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for theContro lof Foot-and-Mouth isease,FAO,Rome,1975:95-100.

[3]Petiot E,Fournier F,Geny C,et al.Rapid screening of serum-free media for the growth of adherent Vero cells by using a small scale and non-vasive tool[J].Appl Biochem Biotechnol，2010,160（6）:1600-1615.

S852.65

A

1006-4907（2016）05-0048-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.020

2016-09-18

公益性行业（农业）科研专项经费（201303046-05）。

安芳兰（1979～），女，汉族，甘肃天水人，助理研究员，硕士，从事口蹄疫疫苗生产及工艺研发，359300818@qq.com。

※通讯作者：殷宏（1966～），男，汉族，甘肃陇西人，研究员，博士生导师，从事口蹄疫及寄生虫学科研究，yinhong@caas.cn。