猪丹毒杆菌活疫苗的安全性试验

邱美珍，蔡文杰，杨俊，王慧，杜丽飞，李杰，周望平

（1.湖南鑫广安农牧股份有限公司，湖南长沙410100；2.湖南省畜牧兽医研究所,湖南长沙410131）

猪丹毒杆菌活疫苗的安全性试验

邱美珍1，2，蔡文杰2，杨俊2，王慧1，2，杜丽飞1，2，李杰1，周望平2

（1.湖南鑫广安农牧股份有限公司，湖南长沙410100；2.湖南省畜牧兽医研究所,湖南长沙410131）

为检测猪丹毒杆菌疫苗的安全性，试验分为猪丹毒疫苗原液组（A1、A2)，猪丹毒疫苗分离组(B1、B2)，猪场猪丹毒分离组(C1、C2)，阳性参照组(D1、D2），阴性参照组E，共九组，每组菌液2个梯度，每个梯度菌液接种10只小鼠。同时疫苗还注射30～40日龄仔猪30头，观察小鼠、小猪生长、死亡、精神状况、剖检情况。结果显示，与疫苗相关的菌株A、B、C组感染小鼠后，小鼠体重、生长、精神状况、剖检情况与阴性参照组相比，没有显著差异，实验结束没有死亡，而阳性参照组小鼠在感染24小时后，出现松毛，扎堆、不食、皮肤发红、精神颓废、于72小时内全部死亡。疫苗注射小猪后，小猪精神状态、生长与对照组相比没有明显差异。结果表明，本试验用猪丹毒杆菌疫苗批次对小鼠、小猪是安全的。

猪丹毒杆菌；疫苗；安全性试验

猪丹毒杆菌是一个古老的病原菌，可寄生于哺乳动物、禽和鱼类，还可感染人，猪丹毒杆菌感染猪将引起一种急性热性传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块(亚急性)、慢性疣状心内膜炎、皮肤坏死及多发性非化脓性关节炎[1-2]。本病一年四季均可发生，炎热多雨季节多发尤其是洪灾后。猪丹毒还是一种内源性疾病，当猪抵抗力下降、环境条件恶化、菌毒力增强常引起该病的爆发。目前，该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了巨大的经济损失。最好的控制方式还是疫苗免疫，本实验旨在检验疫苗的安全性，为猪场疫苗的注射提供安全性参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

营养肉汤自制、血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司，昆明小鼠购自湖南斯莱克公司。

1.2 猪丹毒实验菌株

猪丹毒疫苗株（由某公司生产，编号1604002），疫苗分离菌株（从猪丹毒疫苗中分离细菌），疫苗注射后猪场分离菌株；猪丹毒阳性菌株：为某猪场病死猪分离细菌，由湖南省畜牧兽医研究所兽医研究室分离保存。

1.3 细菌的分离纯化[3]

采集疫苗注射5天后猪心血、病死猪的心血（某猪场）、通过纯水稀释疫苗（疫苗原液菌株）无菌接种于含5%血琼脂平板，37℃倒置培养24 h后观察菌落的生长。无菌挑取单个菌落进行进一步的纯化，纯化3次后，挑取单个菌落进行革兰氏染色。

1.4 试验方法

试验总共分为猪丹毒疫苗原液组（A1、A2)，猪丹毒疫苗分离组(B1、B2)，猪场猪丹毒分离组(C1、C2)，阳性参照组(D1、D2），阴性参照组E，共9组，每组10只小鼠，每种菌液10倍稀释成2个梯度，每个梯度菌液接种10只小鼠。

具体操作如下：将猪丹毒疫苗冻干粉根据说明书稀释成2头份/mL（1.82×109CFU/mL）、0.2头份/mL（1.82×108CFU/mL）。将分离纯化的菌株（或菌苗）接种到含5%犊牛血清的营养肉汤中，37℃摇床培养24h。取菌液用营养肉汤10倍稀释，进行活菌平板计数。然后，将计数稀释后的1mL菌液（1.82× 109CFU/mL或者1.82×108CFU/mL）腹腔注射感染小鼠，对照组仅腹腔注射营养肉汤1mL。连续观察7d，记录各组小鼠的死亡情况。另外，剖检观察小鼠的心、肝、脾、肺、肾和淋巴结。同时，该批次疫苗注射30～40日龄小猪30头，观察7d，记录小猪饮食、生长和精神状况。小鼠实验设计分组及注射菌量、体积见表1。

表1 猪丹毒安全性实验设计分组

1.5 评价指标

记录和统计各组小鼠及小猪的精神、生长、死亡情况和解剖病变。

2 结果

2.1 小鼠精神、生长、死亡情况、解剖病变

小鼠接种细菌后，每天观察小鼠精神状况、死亡情况、于实验后7天称重、剖检小鼠观察病变。结果表明与疫苗相关的菌株A、B、C组感染小鼠后，小鼠体重、生长、精神状况、剖检情况与阴性参照组相比，没有显著差异，体重都有所增加，实验结束没有死亡，而阳性参照组小鼠在感染24小时后，出现松毛，扎堆、不食、皮肤发红、精神颓废、于72小时内全部死亡。死亡小鼠剖检病变主要有心耳出血，肺部有局部弥漫性出血，肝脏坏死灶，脾脏梗死等。结果见表2。

表2 猪丹毒安全性实验小鼠体重、死亡情况

2.2 小猪精神、生长、死亡情况

疫苗注射小猪后，小猪精神状态、生长与对照组相比没有明显差异。在实验期内，没有死亡猪只。

3 讨论

近几年猪病的复杂多元化，“高热病”经常肆虐，猪场重点放在了几种主要猪病的免疫(如猪瘟、猪伪狂犬病、猪蓝耳病等)，另外，由于猪丹毒病的抗生素治疗效果好，从而忽略了猪丹毒的防疫。近期，全国很多县市出现洪灾，造成猪群抵抗力下降，猪丹毒作为一种内源性的细菌在全国各地均有零星发生的报道，有小范围流行的可能性[4-5]。本实验旨在为猪丹毒疫苗防疫提供安全性检测。结果表明猪丹毒疫苗对小鼠和仔猪都是安全的，值得注意的是猪丹毒免疫必须在猪只健康的基础上方可进行，避开重胎期。猪只亚健康和重胎等非常状态下活疫苗免疫可能应激会大，造成不必要的经济损失，非常状态下的猪丹毒免疫安全性还有待进一步探讨。猪丹毒病的出现势必会加重抗生素的使用，造成很多耐药菌株的出现。之前的药敏试验表明，临床分离的猪丹毒杆菌能耐多种抗生素，如庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、林克霉素、和多黏菌素B等，给猪丹毒病的临床预防和治疗带来了很大的困扰[6]。所以，但愿猪丹毒疫苗预防能提上猪病防控的议程。

[1]车勇良,陈如敬,王隆柏.猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析[J].中国兽医学报,2011,31(1):1591-1594.

[2]Hassanein R,Sawada T,Kataoka Y,et a1.Pathogenicity for mice and swine of Erysipelothrix isolates from the tonsils of healthy cattle[J].Vet Microbiol,2003,91(23):231-238.

[3]薛涛,顾丛丛,高崧,等.江苏某奶牛场健康奶牛体内产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及其对小鼠致病性的研究[J].畜牧兽医学报, 2011,42(6):830-837.

[4]薛辉,秦树英,於庆雄,等．广西猪丹毒杆菌分离鉴定及生物学特性研究[J].养猪,2014(6):97-100.

[5]王千菊,陈坚,巫月生,等.一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及其对活疫苗免疫猪的攻毒试验[J].广东畜牧兽医科技,2014,39(2):29-33．

[6]邱美珍,杜丽飞,杨爱梅,等.猪丹毒杆菌临床分离鉴定与药敏试验[J].养猪,2011,119(6):111-112.

S852.65

A

1006-4907（2016）05-0039-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2016.05.016

2016-07-15